Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik.İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında məhdud CSS dəstəyi var.Ən yaxşı nəticələr üçün brauzerinizin daha yeni versiyasını istifadə etməyi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyi) tövsiyə edirik.Bu arada, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı üslub və ya JavaScript olmadan göstəririk.
Təbii məhsulların kəşfi və faydalı istifadəsi insan həyatını yaxşılaşdırmağa kömək edə bilər.Bitki böyüməsini maneə törədən kimyəvi maddələr alaq otlarına qarşı mübarizə üçün herbisid kimi geniş istifadə olunur.Müxtəlif növ herbisidlərdən istifadə zərurəti ilə əlaqədar olaraq yeni təsir mexanizmləri olan birləşmələrin müəyyənləşdirilməsinə ehtiyac yaranır.Bu araşdırmada Streptomyces werraensis MK493-CF1-dən yeni N-alkoksipirol birləşməsini, kumamonamidi kəşf etdik və tam sintez prosesini qurduq.Bioloji aktivlik analizləri vasitəsilə biz aşkar etdik ki, urs-monoamik turşusu urs-monoamidin sintetik ara məhsulu və potensialbitki böyüməsi inhibitoru.Bundan əlavə, biz HeLa hüceyrələrinin böyüməsinə mənfi təsir göstərmədən yüksək herbisid aktivliyə malik olan urbeniloksi törəməsi (UDA) daxil olmaqla, müxtəlif urbenon turşusu törəmələri hazırlamışıq.Biz həmçinin urmotonik turşu törəmələrinin bitki mikrotubullarını pozduğunu aşkar etdik;əlavə olaraq, KAND aktin filamentlərinə təsir edir və hüceyrə ölümünə səbəb olur;Bu çoxşaxəli təsirlər məlum mikrotubul inhibitorlarının təsirlərindən fərqlənir və yeni herbisidlərin hazırlanmasında mühüm üstünlüyü təmsil edən urson turşusunun yeni təsir mexanizmini təklif edir.
Faydalı təbii məhsulların və onların törəmələrinin kəşfi və praktik tətbiqi insan həyatının keyfiyyətinin yüksəldilməsi vasitəsidir.Mikroorqanizmlər, bitkilər və həşəratlar tərəfindən istehsal edilən ikincil metabolitlər tibb və kənd təsərrüfatında böyük irəliləyişlərə səbəb olmuşdur.Təbii məhsullardan çoxlu antibiotiklər və leykemiya əleyhinə dərmanlar hazırlanıb.Bundan əlavə, müxtəlif növlərpestisidlər, kənd təsərrüfatında istifadə üçün bu təbii məhsullardan funqisidlər və herbisidlər çıxarılır.Xüsusilə, alaq otlarına qarşı mübarizə aparan herbisidlər müasir kənd təsərrüfatında məhsuldarlığın artırılması üçün mühüm vasitədir və müxtəlif növ birləşmələr artıq kommersiya məqsədləri üçün istifadə olunur.Bitkilərdə fotosintez, amin turşularının mübadiləsi, hüceyrə divarının sintezi, mitozun tənzimlənməsi, fitohormon siqnalı və ya zülal sintezi kimi bir neçə hüceyrə prosesləri herbisidlərin tipik hədəfləri hesab olunur.Mikrotubul funksiyasını maneə törədən birləşmələr mitotik tənzimləməyə təsir edərək bitki böyüməsinə təsir edən ümumi herbisidlər sinfidir2.
Mikrotubullar sitoskeletonun komponentləridir və eukaryotik hüceyrələrdə geniş şəkildə qorunur.Tubulin heterodimer α-tubulin və β-tubulindən ibarətdir, xətti mikrotubul protofilamentləri əmələ gətirir, 13 protofilament isə silindrik bir quruluş yaradır.Mikrotubullar bitki hüceyrələrində hüceyrə formasını, hüceyrə bölünməsini və hüceyrədaxili nəqli təyin etmək də daxil olmaqla bir çox rol oynayır3,4.Bitki hüceyrələrində fazalararası plazma membranının altında mikrotubullar var və bu kortikal mikrotubulların sellüloza sintaza komplekslərinin tənzimlənməsi yolu ilə sellüloza mikrofibrillərinin təşkilinə nəzarət etdiyi düşünülür4,5.Kök ucunun sürətli uzanma zonasında mövcud olan kök epidermal hüceyrələrinin kortikal mikrotubulları yanal yerləşmişdir və sellüloza mikrolifləri bu mikrotubulları izləyir və hüceyrə genişlənməsinin istiqamətini məhdudlaşdırır və bununla da hüceyrənin anizotrop uzanmasını təşviq edir.Buna görə də mikrotubul funksiyası bitki morfologiyası ilə sıx bağlıdır.Tubulini kodlayan genlərdə amin turşularının dəyişdirilməsi kortikal mikrotubul massivlərinin əyilməsinə və Arabidopsis 6,7-də sol və ya sağ tərəfli böyüməyə səbəb olur.Eynilə, mikrotubul dinamikasını tənzimləyən mikrotubulla əlaqəli zülallardakı mutasiyalar da kök böyüməsinin pozulmasına səbəb ola bilər8,9,10,11,12,13.Bundan əlavə, pretilaxlor kimi tanınan disopiramid kimi mikrotübülləri pozan herbisidlərlə müalicə də sol tərəfli əyri kök böyüməsinə səbəb olur14.Bu məlumatlar göstərir ki, mikrotubul funksiyasının dəqiq tənzimlənməsi bitki böyüməsinin istiqamətini müəyyən etmək üçün çox vacibdir.
Müxtəlif növ mikrotubul inhibitorları aşkar edilmişdir və bu dərmanlar sitoskeletal tədqiqatlara, eləcə də kənd təsərrüfatı və təbabətə mühüm töhfələr vermişdir2.Xüsusilə, orizalin, dinitroanilin birləşmələri, disopiramid, benzamid ilə əlaqəli birləşmələr və onların analoqları mikrotubul funksiyasını maneə törədə və bununla da bitki böyüməsini maneə törədə bilər.Buna görə də onlar herbisid kimi geniş istifadə olunur.Bununla belə, mikrotubullar bitki və heyvan hüceyrələrinin mühüm tərkib hissəsi olduğundan, əksər mikrotubul inhibitorları hər iki hüceyrə növü üçün sitotoksikdir.Buna görə də, herbisidlər kimi tanınan faydalılığına baxmayaraq, praktiki məqsədlər üçün məhdud sayda antimikrotubul agentləri istifadə olunur.
Streptomyces, aerob, qram-müsbət, filamentli bakteriyaları ehtiva edən və geniş spektrli ikincil metabolitlər istehsal etmək qabiliyyəti ilə məşhur olan Streptomyces ailəsinin cinsidir.Buna görə də o, yeni bioloji aktiv təbii məhsulların ən mühüm mənbələrindən biri hesab olunur.Cari tədqiqatda biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 və S. werraensis ISP 5486-dan təcrid olunmuş kumamonamid adlı yeni birləşmə kəşf etdik. Spektral analiz və tam spektral analizdən istifadə edərək kumamonamidin strukturu və onun unikal N-alkoksipirrol skeleti səciyyələndirildi. müəyyən edilmişdi.sintez.Ursmonoamid və onun törəmələrinin sintetik ara məhsulu olan ursmon turşusunun məşhur model bitki olan Arabidopsis thaliana-nın böyüməsini və cücərməsini maneə törətdiyi aşkar edilmişdir.Struktur-fəaliyyət əlaqəsi araşdırmasında biz urson turşusunun (KAND) noniloksi törəməsi adlanan urson turşusuna dəyişdirilmiş C9 ilə birləşmənin böyümə və cücərmə üzərində inhibitor təsirini əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını aşkar etdik.Qeyd etmək lazımdır ki, yeni kəşf edilmiş bitki böyüməsi inhibitoru tütün və qaraciyərin böyüməsinə də təsir etdi və bakteriyalar və ya HeLa hüceyrələri üçün sitotoksik deyildi.Üstəlik, bəzi urmotonik turşu törəmələri təhrif olunmuş kök fenotipinə səbəb olur ki, bu da bu törəmələrin birbaşa və ya dolayı yolla mikrotubullara təsir etdiyini göstərir.Bu fikrə uyğun olaraq, immunohistokimyəvi və ya flüoresan zülallarla etiketlənmiş mikrotubullara dair müşahidələrimiz göstərir ki, KAND müalicəsi mikrotubulları depolimerləşdirir.Bundan əlavə, kumamotonik turşu törəmələri ilə müalicə aktin mikrofilamentlərini pozdu.Beləliklə, biz unikal təsir mexanizmi sitoskeletin məhv edilməsini nəzərdə tutan yeni bitki böyüməsi inhibitorunu kəşf etdik.
MK493-CF1 ştammı Tokioda, Şinaqava-kuda torpaqdan təcrid edilmişdir.MK493-CF1 ştammı yaxşı budaqlanmış stromal miselyum əmələ gətirdi.16S ribosomal RNT geninin (1422 bp) qismən ardıcıllığı müəyyən edilmişdir.Bu ştam S. werraensis-ə çox oxşardır (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik gərginlik, 99,93%).Bu nəticəyə əsasən müəyyən edilmişdir ki, bu ştamm S. werraensis növ ştammı ilə sıx əlaqəlidir.Buna görə də biz müvəqqəti olaraq bu ştammı S. werraensis MK493-CF1 adlandırdıq.S. werraensis ISP 5486T də eyni bioaktiv birləşmələri istehsal edir.Bu mikroorqanizmdən təbii məhsullar əldə etmək üçün erkən tədqiqatlar az olduğundan, əlavə kimyəvi tədqiqatlar aparılmışdır.S. werraensis MK493-CF1 arpa mühitində 14 gün ərzində 30°C-də bərk vəziyyətdə fermentasiya yolu ilə becərildikdən sonra mühit 50% EtOH ilə ekstraksiya edilmişdir.59,5 mq xam ekstraktı əldə etmək üçün 60 ml nümunə qurudulmuşdur.Xam çıxarış N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamid (1, kumamonamid adlı, 36.0 mq) vermək üçün əks fazalı HPLC-yə məruz qaldı.1-in ümumi miqdarı xam ekstraktın təxminən 60%-ni təşkil edir.Buna görə də kumamotoamid 1-in xüsusiyyətlərini ətraflı öyrənmək qərarına gəldik.
Coumamonamide 1 ağ amorf tozdur və yüksək rezolyusiyaya malik kütlə spektrometriyası (HRESIMS) C6H8N2O2-ni təsdiq edir (Şəkil 1).Bu birləşmənin C2 ilə əvəzlənmiş pirol fraqmenti δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR spektrində: 4.5 Hz) ilə xarakterizə olunur. , H-5) və δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) və 13C NMR spektri dörd sp2 karbon atomunun mövcudluğunu göstərir.C2 mövqeyində bir amid qrupunun olması δC 161.1-də C-3 protonundan amid karbonil karbona HMBC korrelyasiyası ilə qiymətləndirildi.Bundan əlavə, δH 4.10 (3H, S) və δC 68.3-də 1 H və 13 C NMR pikləri molekulda N-metoksi qruplarının mövcudluğunu göstərir.Metoksi qrupunun düzgün mövqeyi, gücləndirilmiş fərq spektroskopiyası və nüvə Overhauser abbreviaturası (NOEDF) kimi spektroskopik analizdən istifadə etməklə hələ müəyyən edilməsə də, N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid ilk namizəd birləşmə oldu.
1-in düzgün strukturunu müəyyən etmək üçün ümumi sintez aparılmışdır (şəkil 2a).Ticarətdə mövcud olan 2-aminopiridin 2-nin m-CPBA ilə müalicəsi kəmiyyət məhsuldarlığında müvafiq N-oksid 3 ilə nəticələndi.2-nin 2-aminoazidləşməsindən sonra Abramoviç tərəfindən təsvir edilən siklokondensasiya reaksiyası qramla istədiyiniz 1-hidroksi-1H-pirrol-2-karbonitril 5-i əldə etmək üçün benzolda 90°C-də aparıldı.Sürət 60% (iki mərhələ).15,16.4-ün metilasiyası və hidrolizi daha sonra yaxşı məhsuldarlıqla (70%, iki addım) 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik turşusu (“kumotonik turşu” adlandırılır) verdi.Nəhayət, sulu ammonyak istifadə edərək turşu xlorid aralıq 6 vasitəsilə amidasiya Kumamoto amid 1-ə 98% məhsul verdi.Sintez edilmiş 1-in bütün spektral məlumatları təcrid olunmuş 1-ə bənzəyirdi, buna görə də 1-in strukturu müəyyən edildi;
Urbenamid və urben turşusunun bioloji aktivliyinin ümumi sintezi və təhlili.(a) Kumamoto amidinin ümumi sintezi.(b) Yeddi günlük yabanı tipli Arabidopsis Columbia (Col) şitilləri göstərilən konsentrasiyalarda kumamonamid 6 və ya kumamonamid 1 olan Murashige və Skoog (MS) lövhələrində yetişdirilmişdir.Ölçək çubuğu = 1 sm.
Birincisi, biz urbenamidin və onun aralıq məhsullarının bitki böyüməsini modulyasiya etmək qabiliyyətinə görə bioloji fəaliyyətlərini qiymətləndirdik.Biz bu mühitdə MS agar mühitinə və becərilmiş Arabidopsis thaliana tinglərinə müxtəlif konsentrasiyalarda ursmonamid 1 və ya ursmon turşusu 6 əlavə etdik.Bu analizlər göstərdi ki, yüksək konsentrasiyalar (500 μM) 6 kök böyüməsini maneə törədir (Şəkil 2b).Sonra, 6-nın N1 mövqeyini əvəz etməklə müxtəlif törəmələr yaratdıq və onlar üzərində struktur-fəaliyyət əlaqəsi tədqiqatları apardıq (analoq sintez prosesi Dəstəkləyici Məlumatda (SI) təsvir edilmişdir).Arabidopsis tingləri 50 μM urson turşusu törəmələri olan mühitdə yetişdirilmiş və kök uzunluğu ölçülmüşdür.şəkildə göstərildiyi kimi.Şəkil 3a, b və S1-də göstərildiyi kimi, kumamo turşuları N1 mövqeyində müxtəlif uzunluqlu xətti alkoksi zəncirlərinə (9, 10, 11, 12 və 13) və ya böyük alkoksi zəncirlərinə (15, 16 və 17) malikdirlər.Törəmələr kök böyüməsini əhəmiyyətli dərəcədə inhibə etdi.Bundan əlavə, biz 200 μM 10, 11 və ya 17 tətbiqinin cücərməni maneə törətdiyini aşkar etdik (şək. 3c və S2).
Kumamoto amidinin və əlaqəli birləşmələrin struktur-fəaliyyət əlaqəsinin öyrənilməsi.(a) Analoqların strukturu və sintez sxemi.(b) 50 μM kumamonamid törəmələri olan və ya olmayan MS mühitində yetişdirilən 7 günlük şitillərin kök uzunluğunun kəmiyyətinin müəyyən edilməsi.Ulduz işarələri saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (t testi, s< 0,05).n>18. Məlumatlar orta ± SD kimi göstərilir.nt “sınaqdan keçməmiş” deməkdir, çünki toxumların 50%-dən çoxu cücərməmişdir.(c) 200 μM kumamonamid və əlaqəli birləşmələrlə və ya olmayan MS mühitində 7 gün inkubasiya edilmiş müalicə olunmuş toxumların cücərmə sürətinin kəmiyyəti.Ulduz işarələri saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (xi-kvadrat testi).n=96.
Maraqlıdır ki, C9-dan daha uzun olan alkil yan zəncirlərinin əlavə edilməsi inhibitor fəaliyyətini azaldıb və bu, kumamotoik turşusu ilə əlaqəli birləşmələrin bioloji aktivliyini nümayiş etdirmək üçün müəyyən ölçülü yan zəncirlər tələb etdiyini göstərir.
Struktur-fəaliyyət əlaqəsi təhlili göstərdi ki, C9 urson turşusuna dəyişdirilib və urson turşusunun noniloksi törəməsi (bundan sonra KAND 11 adlandırılacaq) ən təsirli bitki böyüməsi inhibitoru olub, biz KAND 11-in daha ətraflı səciyyələndirilməsini apardıq. Arabidopsisin müalicəsi 50 μM KAND 11 ilə demək olar ki, tamamilə cücərmənin qarşısını aldı, KAND 11-in daha aşağı konsentrasiyaları (40, 30, 20 və ya 10 μM) dozadan asılı olaraq kök böyüməsini maneə törətdi (Şəkil 4a, b).KAND 11-in kök meristem canlılığına təsir edib-etmədiyini yoxlamaq üçün biz propidium yodid (PI) ilə boyanmış kök meristemlərini araşdırdıq və meristem sahəsinin ölçüsünü ölçdük.Tərkibində 25 μM KAND-11 olan mühitdə yetişdirilən tinglərin meristeminin ölçüsü 151,1 ± 32,5 mkm, DMSO tərkibli nəzarət mühitində yetişdirilən tinglərin meristeminin ölçüsü isə 264,7 ± 30,8 mkm (şək. 4c, d) olmuşdur. , bu KAND-11-in hüceyrə fəaliyyətini bərpa etdiyini göstərir.yayılması.Kök meristem.Buna uyğun olaraq, KAND 11 müalicəsi kök meristemdə hüceyrə bölünməsi marker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS siqnalının miqdarını azaldıb (Şəkil 4e) 17.Bu nəticələr göstərir ki, KAND 11 hüceyrə proliferasiya fəaliyyətini azaldaraq kök böyüməsini maneə törədir.
Urbenon turşusu törəmələrinin (urbeniloksi törəmələri) böyüməyə inhibitor təsirinin təhlili.(a) KAND 11-in göstərilən konsentrasiyaları ilə MS lövhələrində yetişdirilmiş 7 günlük yabanı tipli Col şitilləri. Ölçək çubuğu = 1 sm.(b) Kök uzunluğunun kəmiyyəti.Məktublar əhəmiyyətli fərqləri göstərir (Tukey HSD testi, s< 0,05).n>16. Məlumatlar orta ± SD kimi göstərilir.(c) 25 μM KAND 11 olan və ya olmayan MS lövhələrində yetişdirilmiş propidium yodidlə boyanmış vəhşi tipli Col köklərinin konfokal mikroskopiyası. Ağ mötərizələr kök meristemini göstərir.Ölçək çubuğu = 100 µm.(d) Kök meristem ölçüsünün kəmiyyəti (n = 10-11).Statistik fərqlər t-testindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir (səh< 0,05).Barlar orta meristem ölçüsünü təmsil edir.(e) CDKB2 konstruksiyasını ehtiva edən kök meristeminin diferensial müdaxilə kontrast (DIC) mikroskopiyası;1pro: CDKB2;25 µM KAND analizi olan və ya olmayan MS plitələrində yetişdirilmiş 5 günlük şitillərdə 1-GUS boyandı və boyandı.
KAND 11-in fitotoksisitesi başqa ikiotilli bitki, tütün (Nicotiana tabacum) və əsas quru bitki modeli orqanizm olan qara ciyər (Marchantia polymorpha) istifadə edilməklə əlavə sınaqdan keçirilmişdir.Arabidopsis vəziyyətində olduğu kimi, tərkibində 25 μM KAND 11 olan mühitdə yetişdirilən tütün SR-1 tingləri daha qısa köklər əmələ gətirir (şək. 5a).Bundan əlavə, 48 toxumdan 40-ı tərkibində 200 μM KAND 11 olan lövhələrdə cücərmiş, halbuki 48 toxumun hamısı saxtalaşdırılmış mühitlərdə cücərmişdir ki, bu da KAND-ın daha yüksək konsentrasiyalarının əhəmiyyətli olduğunu göstərir (p).< 0,05;chi testi -kvadrat) tütünün cücərməsini maneə törədir.(Şəkil 5b).Bundan əlavə, qaraciyərdə bakteriya artımını maneə törədən KAND 11 konsentrasiyası Arabidopsisdəki effektiv konsentrasiyaya oxşar idi (Şəkil 5c).Bu nəticələr KAND 11-in müxtəlif bitkilərin böyüməsini maneə törədə biləcəyini göstərir.Daha sonra biz daha yüksək heyvan və bakteriya hüceyrələrinin nümayəndələri kimi digər orqanizmlərdə, yəni insan HeLa hüceyrələrində və Escherichia coli ştammı DH5α-da ayı monoamidlə əlaqəli birləşmələrin mümkün sitotoksikliyini araşdırdıq.Hüceyrə proliferasiyasının bir sıra analizlərində biz kumamonamid 1, kumamonamid turşusu 6 və KAND 11-in 100 μM konsentrasiyalarda HeLa və ya E. coli hüceyrələrinin böyüməsinə təsir etmədiyini müşahidə etdik (Şəkil 5d, e).
Qeyri-Arabidopsis orqanizmlərində KAND 11-in böyüməsini maneə törədir.(a) İki həftəlik yabanı tipli SR-1 tütün şitilləri 25 μM KAND 11 ehtiva edən şaquli şəkildə yerləşdirilmiş MS lövhələrində yetişdirildi. (b) İki həftəlik yabanı tipli SR-1 tütün tingləri üfüqi şəkildə yerləşdirilən yerdə yetişdirildi. Tərkibində 200 μM KAND 11 olan MS lövhələri. (c) Göstərilən KAND 11 konsentrasiyası ilə Gamborg B5 lövhələrində yetişdirilmiş iki həftəlik vəhşi tip Tak-1 qaraciyər qönçələri. Qırmızı oxlar iki həftəlik inkubasiya ərzində böyüməyi dayandıran sporları göstərir. dövr.(d) HeLa hüceyrələrinin hüceyrə proliferasiyası təhlili.Canlı hüceyrələrin sayı hüceyrə sayma dəsti 8 (Dojindo) istifadə edərək sabit vaxt intervallarında ölçüldü.Nəzarət olaraq, HeLa hüceyrələri RNT polimeraz transkripsiyasını maneə törədən və hüceyrə ölümünə səbəb olan 5 μg/ml aktinomisin D (akt D) ilə müalicə olundu.Təhlillər üç nüsxədə aparıldı.(e) E. coli hüceyrə proliferasiyası analizi.E. coli artımı OD600 ölçməklə təhlil edilmişdir.Nəzarət olaraq hüceyrələr bakterial hüceyrə divarının sintezini maneə törədən 50 μg/ml ampisilin (Amp) ilə müalicə olundu.Təhlillər üç nüsxədə aparıldı.
Uramidlə əlaqəli birləşmələrin yaratdığı sitotoksikliyin təsir mexanizmini deşifrə etmək üçün orta dərəcədə inhibitor təsiri olan urben turşusu törəmələrini yenidən təhlil etdik.şəkildə göstərildiyi kimi.Şəkil 2b, 6a-da göstərildiyi kimi, tərkibində yüksək konsentrasiyalarda (200 μM) urmotonik turşu 6 olan agar lövhələrində yetişdirilən tinglər daha qısa və sola əyilmiş köklər (θ = – 23,7 ± 6,1) əmələ gətirir, nəzarət mühitində yetişdirilən tinglərdə isə fidanlar demək olar ki, düz köklər əmələ gətirir (θ = – 3,8 ± 7,1).Bu xarakterik əyri böyümənin kortikal mikrotubulların disfunksiyası nəticəsində məlumdur14,18.Bu tapıntıya uyğun olaraq, mikrotubula sabitliyini pozan dərmanlar disopiramid və orzalin böyümə şərtlərimizdə oxşar kök əyilməsinə səbəb oldu (Şəkil 2b, 6a).Eyni zamanda, biz urmotonik turşu törəmələrini sınaqdan keçirdik və müəyyən konsentrasiyalarda əyri kök böyüməsinə səbəb olan bir neçəsini seçdik.8, 9 və 15-ci birləşmələr müvafiq olaraq 75 μM, 50 μM və 40 μM-də kök böyüməsinin istiqamətini dəyişdirdi, bu birləşmələrin mikrotubulları effektiv şəkildə destabilizasiya edə biləcəyini göstərir (Şəkil 2b, 6a).Biz həmçinin ən güclü ursolat turşusu törəməsi olan KAND 11-i daha aşağı konsentrasiyada (15 µM) sınaqdan keçirdik və KAND 11-in tətbiqinin kök böyüməsini maneə törətdiyini və kök böyüməsinin istiqamətinin qeyri-bərabər olduğunu, baxmayaraq ki, onlar sola meyllidirlər ( Şəkil C3)..Mikrotubulları destabilləşdirən dərmanların daha yüksək konsentrasiyası bəzən köklərin əyilməsinə səbəb olmaqdansa, bitki böyüməsini maneə törətdiyinə görə, biz sonradan KAND 11-in kök epidermal hüceyrələrində kortikal mikrotubulları müşahidə edərək mikrotubullara təsir etmə ehtimalını qiymətləndirdik.25 μM KAND 11 ilə müalicə olunan fidan köklərinin epidermal hüceyrələrində anti-β-tubulin antikorlarından istifadə edərək immunohistokimya uzanma zonasında epidermal hüceyrələrdə demək olar ki, bütün kortikal mikrotubulların yox olduğunu göstərdi (Şəkil 6b).Bu nəticələr göstərir ki, kumamoton turşusu və onun törəmələri birbaşa və ya dolayı yolla mikrotubullara təsir edərək onları pozur və bu birləşmələr yeni mikrotubul inhibitorlarıdır.
Urson turşusu və onun törəmələri Arabidopsis thaliana-da kortikal mikrotubulları dəyişdirir.(a) Göstərilən konsentrasiyalarda müxtəlif urmotonik turşu törəmələrinin iştirakı ilə ölçülən kök meyl bucağı.Mikrotubulları inhibə etdiyi bilinən iki birləşmənin təsiri də təhlil edilmişdir: disopiramid və orzalin.Daxil kök böyümə bucağını ölçmək üçün istifadə olunan standartı göstərir.Ulduzlar saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (t testi, s< 0,05).n>19. Ölçək çubuğu = 1 sm.(b) uzanma zonasında epidermal hüceyrələrdə kortikal mikrotubullar.25 μM KAND 11 olan və ya olmayan MS plitələrində yetişdirilmiş vəhşi tipli Arabidopsis Col köklərindəki mikrotubullar β-tubulin əsas anticisimləri və Alexa Fluor ilə birləşdirilmiş ikincili antikorlardan istifadə edərək immunohistokimyəvi boyanma yolu ilə görüntülənmişdir.Ölçək çubuğu = 10 µm.(c) Kök meristemində mikrotubulların mitotik quruluşu.Mikrotubullar immunohistokimyəvi boyanma ilə vizuallaşdırıldı.Mitotik strukturlar, o cümlədən profilaktika zonaları, millər və fraqmoplastlar konfokal şəkillərdən hesablanıb.Oklar mitotik mikrotubul quruluşlarını göstərir.Ulduzlar saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (t testi, s< 0,05).n>9. Ölçək çubuğu = 50 µm.
Ursa mikrotubul funksiyasını pozmaq qabiliyyətinə malik olsa da, onun təsir mexanizminin tipik mikrotubul depolimerləşdirici maddələrindən fərqli olacağı gözlənilir.Məsələn, disopiramid və orzalin kimi mikrotubul depolimerləşdirici maddələrin daha yüksək konsentrasiyası epidermal hüceyrələrin anizotrop genişlənməsinə səbəb olur, KAND 11 isə bunu etmir.Bundan əlavə, KAND 11 və disopiramidin birgə tətbiqi birləşmiş disopiramidin səbəb olduğu kök böyüməsi reaksiyası ilə nəticələndi və KAND 11-in səbəb olduğu böyümə inhibəsi müşahidə edildi (Şəkil S4).Biz həmçinin hiperhəssas disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantının KAND 11-ə reaksiyasını təhlil etdik. phs1-1 qeyri-kanonik tubulin kinaz nöqtəsi mutasiyasına malikdir və disopiramid ilə müalicə edildikdə daha qısa köklər əmələ gətirir9,20.Tərkibində KAND 11 olan agar mühitində yetişdirilən phs1-1 mutant şitilləri disopiramiddə yetişdirilənlərə bənzər daha qısa köklərə malik idi (şək. S5).
Bundan əlavə, biz KAND 11 ilə müalicə olunan şitillərin kök meristemində profaza zonaları, millər və fraqmoplastlar kimi mitotik mikrotubul strukturlarını müşahidə etdik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS üçün müşahidələrə uyğun olaraq, əhəmiyyətli azalma mitotik mikrotubulların sayı müşahidə edilmişdir (şəkil .6c).
KAND 11-in hüceyrəaltı rezolyusiyada sitotoksikliyini xarakterizə etmək üçün biz tütünün BY-2 süspansiyon hüceyrələrini KAND 11 ilə müalicə etdik və onların reaksiyasını müşahidə etdik.Biz əvvəlcə KAND 11-in kortikal mikrotubullara təsirini qiymətləndirmək üçün mikrotubulları flüoresan şəkildə etiketləyən TagRFP-TUA6-nı ifadə edən BY-2 hüceyrələrinə KAND 11 əlavə etdik.Kortikal mikrotubulun sıxlığı sitoplazmik piksellər arasında sitoskeletal piksellərin faizini müəyyən edən görüntü analizindən istifadə edərək qiymətləndirildi.Təhlil nəticələri göstərdi ki, 1 saat ərzində 50 μM və ya 100 μM KAND 11 ilə müalicə edildikdən sonra sıxlıq müvafiq olaraq 0,94 ± 0,74% və ya 0,23 ± 0,28% -ə qədər əhəmiyyətli dərəcədə azalıb, DMSO ilə müalicə olunan hüceyrələrin sıxlığı isə ± 10,61 təşkil edib. % (Şəkil 7a).Bu nəticələr Arabidopsisdə KAND 11 müalicəsinin kortikal mikrotubulların depolimerizasiyasına səbəb olduğu müşahidəsinə uyğundur (Şəkil 6b).Biz həmçinin eyni KAND 11 konsentrasiyası ilə müalicədən sonra GFP-ABD etiketli aktin filamentləri ilə BY-2 xəttini araşdırdıq və KAND 11 müalicəsinin aktin filamentlərini pozduğunu müşahidə etdik.1 saat ərzində 50 μM və ya 100 μM KAND 11 ilə müalicə aktin filamentinin sıxlığını müvafiq olaraq 1.20 ± 0.62% və ya 0.61 ± 0.26% -ə qədər əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı, halbuki DMSO ilə müalicə olunan hüceyrələrdə sıxlıq 1.65 ± 2% (Fi. 0.69) idi.7b).Bu nəticələr aktin filamentlərinə təsir etməyən propizamidin və mikrotubullara təsir etməyən aktin depolimerizatoru olan latrunkulin B-nin təsirləri ilə ziddiyyət təşkil edir (SI Şəkil S6).Bundan əlavə, kumamonamid 1, kumamonamid turşusu 6 və ya KAND 11 ilə müalicə HeLa hüceyrələrində mikrotubullara təsir göstərməmişdir (SI Şəkil S7).Beləliklə, KAND 11-in təsir mexanizminin məlum sitoskeleton pozucularından fərqli olduğuna inanılır.Bundan əlavə, KAND 11 ilə müalicə olunan BY-2 hüceyrələrinin mikroskopik müşahidəsi KAND 11 müalicəsi zamanı hüceyrə ölümünün başlanğıcını aşkar etdi və göstərdi ki, Evans mavi rəngə boyanmış ölü hüceyrələrin nisbəti KAND 11 ilə müalicədən 30 dəqiqə sonra əhəmiyyətli dərəcədə artmamışdır. 50 μM və ya 100 μM KAND ilə 90 dəqiqəlik müalicədən sonra ölü hüceyrələrin sayı müvafiq olaraq 43.7% və ya 80.1% -ə yüksəldi (Şəkil 7c).Birlikdə götürdükdə, bu məlumatlar göstərir ki, yeni ursol turşusu törəməsi KAND 11, əvvəllər məlum olmayan təsir mexanizmi olan bitkiyə xas sitoskeletal inhibitordur.
KAND kortikal mikrotubullara, aktin filamentlərinə və tütünün BY-2 hüceyrələrinin canlılığına təsir göstərir.(a) TagRFP-TUA6 varlığında BY-2 hüceyrələrində kortikal mikrotubulların vizuallaşdırılması.KAND 11 (50 μM və ya 100 μM) və ya DMSO ilə müalicə olunan BY-2 hüceyrələri konfokal mikroskopiya ilə araşdırıldı.Kortikal mikrotubulun sıxlığı 25 müstəqil hüceyrənin mikroqrafiklərindən hesablanmışdır.Məktublar əhəmiyyətli fərqləri göstərir (Tukey HSD testi, s< 0,05).Ölçək çubuğu = 10 µm.(b) GFP-ABD2 varlığında görüntülənən BY-2 hüceyrələrində kortikal aktin filamentləri.KAND 11 (50 μM və ya 100 μM) və ya DMSO ilə müalicə olunan BY-2 hüceyrələri konfokal mikroskopiya ilə araşdırıldı.Kortikal aktin filamentlərinin sıxlığı 25 müstəqil hüceyrənin mikroqrafiklərindən hesablanmışdır.Məktublar əhəmiyyətli fərqləri göstərir (Tukey HSD testi, s< 0,05).Ölçək çubuğu = 10 µm.(c) Ölü BY-2 hüceyrələrinin Evans mavisi ilə boyanması ilə müşahidəsi.KAND 11 (50 μM və ya 100 μM) və ya DMSO ilə müalicə olunan BY-2 hüceyrələri parlaq sahə mikroskopiyası ilə araşdırıldı.n=3.Ölçək çubuğu = 100 µm.
Yeni təbii məhsulların kəşfi və tətbiqi insan həyatının müxtəlif sahələrində, o cümlədən tibb və kənd təsərrüfatında əhəmiyyətli irəliləyişlərə səbəb olmuşdur.Təbii ehtiyatlardan faydalı birləşmələrin alınması üçün tarixi tədqiqatlar aparılmışdır.Xüsusilə, aktinomisetlərin nematodlar üçün antiparazitar antibiotik kimi faydalı olduğu bilinir, çünki onların avermektin, ivermektin və bleomisinin aparıcı birləşməsi və onun törəmələri kimi müxtəlif ikincili metabolitlər istehsal etmək qabiliyyətinə görə dərmanda xərçəng əleyhinə vasitə kimi istifadə olunur21,22.Eynilə, aktinomisetlərdən müxtəlif herbisid birləşmələr aşkar edilmişdir ki, onlardan bəziləri artıq kommersiya məqsədləri üçün istifadə olunur1,23.Buna görə də arzu olunan bioloji aktivliyə malik təbii məhsulları təcrid etmək üçün aktinomiset metabolitlərinin təhlili effektiv strategiya hesab olunur.Bu araşdırmada biz S. werraensisdən yeni bir birləşmə olan kumamonamid kəşf etdik və onu uğurla sintez etdik.Ursonic turşusu urbenamid və onun törəmələrinin sintetik ara məhsuludur.O, xarakterik kök qıvrılmasına səbəb ola bilər, orta və ya güclü herbisid aktivliyi nümayiş etdirir və birbaşa və ya dolayı yolla bitki mikrotubullarına zərər verə bilər.Bununla belə, urmotonik turşunun təsir mexanizmi mövcud mikrotubul inhibitorlarından fərqli ola bilər, çünki KAND 11 aktin filamentlərini də pozur və hüceyrə ölümünə səbəb olur, bu da urmotonik turşunun və onun törəmələrinin sitoskeletal strukturların geniş spektrinə təsir göstərdiyi tənzimləmə mexanizmini təklif edir..
Urbenon turşusunun daha ətraflı təsviri urbenon turşusunun təsir mexanizmini daha yaxşı başa düşməyə kömək edəcəkdir.Xüsusilə, növbəti məqsəd urson turşusunun və onun törəmələrinin mikrotubullara birbaşa təsir edib onları depolimerləşdirməsini və ya onların fəaliyyətinin mikroborucuqların destabilizasiyası ilə nəticələndiyini müəyyən etmək üçün urson turşusunun azalmış mikroborucuqlara bağlanma qabiliyyətini qiymətləndirməkdir.Bundan əlavə, mikrotubulların birbaşa hədəf olmadığı halda, bitki hüceyrələrində urson turşusunun təsir yerini və molekulyar hədəflərini müəyyən etmək, əlaqəli birləşmələrin xüsusiyyətlərini və herbisid fəaliyyətini yaxşılaşdırmağın mümkün yollarını daha da anlamağa kömək edəcəkdir.Bioaktivlik analizimiz urson turşusunun Arabidopsis thaliana, tütün və qara ciyər kimi bitkilərin böyüməsi üzərində unikal sitotoksik qabiliyyətini aşkar etdi, halbuki nə E. coli, nə də HeLa hüceyrələri təsirlənmədi.Açıq əkinçilik sahələrində istifadə üçün herbisidlər kimi işlənib hazırlanmışsa, urson turşusu törəmələrinin üstünlüyü heyvan hüceyrələrinə toksikliyin az olması və ya olmamasıdır.Həqiqətən, mikrotubullar eukariotlarda ümumi strukturlar olduğundan, onların bitkilərdə seçici inhibə edilməsi herbisidlər üçün əsas tələbdir.Məsələn, propizamid, birbaşa tubulinə bağlanan və polimerləşməni maneə törədən mikrotübüllü depolimerləşdirici agent heyvan hüceyrələri üçün aşağı toksikliyinə görə herbisid kimi istifadə olunur24.Dizopiramiddən fərqli olaraq, əlaqəli benzamidlər fərqli hədəf xüsusiyyətlərinə malikdir.Bitki mikrotubullarına əlavə olaraq, RH-4032 və ya benzoksamid də müvafiq olaraq heyvan hüceyrələrinin və ya oomisetlərin mikrotubullarını inhibə edir və zalilamid aşağı fitotoksisitesi səbəbindən funqisid kimi istifadə olunur25,26,27.Yeni kəşf edilmiş ayı və onun törəmələri bitkilərə qarşı selektiv sitotoksiklik nümayiş etdirir, lakin qeyd etmək lazımdır ki, əlavə modifikasiyalar onların hədəf spesifikliyini dəyişə bilər, potensial olaraq patogen göbələklərin və ya oomisetlərin idarə edilməsi üçün əlavə törəmələr təmin edir.
Urben turşusunun və onun törəmələrinin unikal xassələri onların herbisid kimi hazırlanması və tədqiqat aləti kimi istifadəsi üçün faydalıdır.Bitki hüceyrə formasının idarə edilməsində sitoskeletonun əhəmiyyəti geniş şəkildə qəbul edilir.Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, bitkilər morfogenezi düzgün idarə etmək üçün mikrotubula dinamikasına nəzarət etməklə kortikal mikrotubulların təşkilinin mürəkkəb mexanizmlərini təkamül etdiriblər.Mikrotubul fəaliyyətinin tənzimlənməsindən məsul olan çoxlu sayda molekul müəyyən edilmişdir və bununla bağlı tədqiqatlar hələ də davam edir3,4,28.Bitki hüceyrələrində mikrotubul dinamikası ilə bağlı hazırkı anlayışımız kortikal mikrotübüllərin təşkili mexanizmlərini tam izah etmir.Məsələn, həm disopiramid, həm də orizalin mikrotubulları depolimerləşdirə bilsə də, disopiramid köklərin ciddi şəkildə pozulmasına səbəb olur, orizalin isə nisbətən yumşaq təsir göstərir.Üstəlik, mikrotubulları stabilləşdirən tubulin mutasiyaları da köklərdə dekstrorotasiyaya səbəb olur, mikrotubulların dinamikasını da stabilləşdirən paklitaksel isə yox.Buna görə də, ursolik turşunun molekulyar hədəflərinin öyrənilməsi və müəyyən edilməsi bitki kortikal mikrotubullarının tənzimlənməsi ilə bağlı yeni anlayışlar təmin etməlidir.Eyni şəkildə, disopiramid kimi təhrif olunmuş böyümənin təşviqində təsirli olan kimyəvi maddələrin və orzalin və ya kumamotor turşusu kimi daha az təsirli kimyəvi maddələrin gələcək müqayisələri təhrif olunmuş böyümənin necə baş verdiyinə dair ipucular verəcəkdir.
Digər tərəfdən, müdafiə ilə əlaqəli sitoskeletal quruluşlar urson turşusunun sitotoksikliyini izah etmək üçün başqa bir imkandır.Patogenin yoluxması və ya elisitorun bitki hüceyrələrinə yeridilməsi bəzən sitoskeletonun məhvinə və sonradan hüceyrənin ölümünə səbəb olur29.Məsələn, oomycete-dən əldə edilən kriptoksantin KAND müalicəsində baş verənlərə bənzər tütün hüceyrələrinin ölümündən əvvəl mikrotubulları və aktin filamentlərini pozduğu bildirilmişdir30,31.Müdafiə reaksiyaları ilə urson turşusunun yaratdığı hüceyrə reaksiyaları arasındakı oxşarlıqlar, urson turşusunun kriptoksantindən daha sürətli və daha güclü təsiri göz qabağında olsa da, onların ümumi hüceyrə proseslərini tetiklediyi fərziyyəsinə səbəb oldu.Bununla belə, tədqiqatlar göstərdi ki, aktin filamentlərinin pozulması hüceyrənin kortəbii ölümünə səbəb olur, bu da həmişə mikrotubulların pozulması ilə müşayiət olunmur29.Bundan əlavə, urson turşusu törəmələri kimi patogen və ya elisitorun təhrif olunmuş kök böyüməsinə səbəb olub-olmadığını görmək qalır.Beləliklə, müdafiə reaksiyaları və sitoskeletonu birləşdirən molekulyar bilik həll edilməli olan cəlbedici bir problemdir.Ursonic turşusu ilə əlaqəli aşağı molekulyar ağırlıqlı birləşmələrin, eləcə də müxtəlif potensiala malik bir sıra törəmələrin mövcudluğundan istifadə edərək, naməlum hüceyrə mexanizmlərini hədəf almaq üçün imkanlar təmin edə bilərlər.
Birlikdə götürüldükdə, mikrotubul dinamikasını modulyasiya edən yeni birləşmələrin kəşfi və tətbiqi bitki hüceyrə formasının təyin edilməsinin altında yatan mürəkkəb molekulyar mexanizmləri həll etmək üçün güclü üsullar təmin edəcəkdir.Bu kontekstdə, mikrotubullara və aktin filamentlərinə təsir edən və hüceyrə ölümünə səbəb olan bu yaxınlarda hazırlanmış mürəkkəb urmotonik turşu mikrotubullara nəzarət və bu digər mexanizmlər arasındakı əlaqəni deşifrə etmək imkanı verə bilər.Beləliklə, urbenon turşusundan istifadə etməklə kimyəvi və bioloji analiz bitki sitoskeletonunu idarə edən molekulyar tənzimləmə mexanizmlərini anlamağa kömək edəcəkdir.
S. werraensis MK493-CF1-i 2% (ağırlıq/həc) qalaktozadan, 2% (ağırlıqda) Essensiya pastası, 1% (ağırlıq/həc) Bakto tərkibi olan 110 mL toxum mühiti olan 500 mL çaşqın Erlenmeyer kolbasına aşılayın. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (ağırlıqda) qarğıdalı ekstraktı (KOGOSTCH Co., Ltd., Yaponiya), 0,2% (ağırlıqda) (NH4)2SO4 və 0,2% CaCO3 deionlaşdırılmış suda.(sterilizasiyadan əvvəl pH 7.4).Toxum mədəniyyətləri 2 gün ərzində 27°C-də fırlanan çalkalayıcıda (180 rpm) inkubasiya edilmişdir.Qatı vəziyyətdə fermentasiya yolu ilə istehsal becərilməsi.Toxum mədəniyyəti (7 ml) 15 q sıxılmış arpa (MUSO Co., Ltd., Yaponiya) və 25 q deionlaşdırılmış sudan (pH tənzimlənməmiş) ibarət 40 q istehsal mühiti olan 500 ml K-1 kolbasına köçürüldü. sterilizasiyadan əvvəl).).Fermentasiya 14 gün ərzində 30 ° C-də qaranlıqda aparıldı.Fermentasiya materialı 40 ml/şüşə EtOH ilə çıxarıldı və sentrifuqa edildi (1500 q, 4°C, 10 dəq).Kultura supernatantı (60 ml) 10% MeOH/EtOAc qarışığı ilə çıxarıldı.Üzvi təbəqə azaldılmış təzyiq altında buxarlanaraq qalıq (59,5 mq) əldə edildi, o, əks faza sütununda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) gradient elüsyonu (0-10 dəqiqə: 90%) ilə HPLC-yə məruz qaldı. 10 mm × uzunluq 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 dəqiqə: 90% H2O/CH3CN - 70% H2O/CH3CN (qradiyent), 35–45 dəqiqə: 90% H2O/EtOH, 45–155 dəqiqə: 90% H2O /EtOH-dan 100% EtOH-a (qradiyent (qradiyent), 155-200 dəq: 100% EtOH) 1,5 ml/dəq axın sürətində kumamonamid (1, 36,0 mq) ağ amorf toz kimi təcrid olundu.
Kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hesablanmış dəyər: 141.0659, ölçülmüş dəyər: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 113.
Kolumbiya toxumları (Col-0) tədqiqat istifadəsi üçün icazə ilə Arabidopsis Bioloji Resurs Mərkəzindən (ABRC) əldə edilmişdir.Col-0 toxumları bizim laboratoriya şəraitində çoxaldılmış və saxlanılmış və yabanı tip Ərəbidopsis bitkiləri kimi istifadə edilmişdir.Arabidopsis toxumları səthi sterilizasiya edilib və tərkibində 2% saxaroza (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfon turşusu (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) olan yarı möhkəm Murashige və Skoog mühitində becərildi. ).) və 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C və daimi işıqda.Phs1-1 mutantının toxumları T. Haşimoto (Nara Elm və Texnologiya İnstitutu) tərəfindən təmin edilmişdir.
SR-1 ştamının toxumları T. Haşimoto (Nara Elm və Texnologiya İnstitutu) tərəfindən verilmiş və yabanı tipli tütün bitkiləri kimi istifadə edilmişdir.Tütün toxumları səthi sterilizasiya edilib və cücərməni sürətləndirmək üçün üç gecə steril suda isladılıb, sonra tərkibində 2% saxaroza, 0,05% (ağırlıq/həc) MES və 0,8% gellan saqqızı (Fujifilm Wako Pure Chemical) olan yarım güclü məhlula yerləşdirilib. Müraşige.və Skoog mühiti) pH 5.7 ilə və daimi işıq altında 23°C-də inkubasiya edilmişdir.
Ştam Tak-1 T. Kohchi (Kyoto Universiteti) tərəfindən təmin edilmişdir və qaraciyər tədqiqatı üçün standart eksperimental vahid kimi istifadə edilmişdir.Gemma sterilizasiya edilmiş mədəni bitkilərdən alınmış və sonra tərkibində 1% saxaroza və 0,3% gellan saqqızı olan Gamborg B5 mühitinə (Fujifilm Wako Pure Chemical) üzlənmiş və 23°C-də davamlı işıq altında inkubasiya edilmişdir.
Tütün BY-2 hüceyrələri (Nicotiana tabacum L. cv. Parlaq Sarı 2) S. Hasezawa (Tokio Universiteti) tərəfindən təmin edilmişdir.BY-2 hüceyrələri dəyişdirilmiş Linsmeier və Skoog mühitində 95 dəfə seyreltildi və həftəlik 2,4-diklorofenoksiasetik turşu 32 ilə əlavə edildi.Hüceyrə suspenziyası qaranlıqda 27°C-də 130 rpm-də fırlanan çalkalayıcıda qarışdırıldı.Hüceyrələri 10 qat həcmdə təzə mühitlə yuyun və eyni mühitdə yenidən dayandırın.Karnabahar mozaika virusu 35S promotoru altında mikrotubul markerini TagRFP-TUA6 və ya aktin filament markerini GFP-ABD2-ni stabil şəkildə ifadə edən BY-2 transgen hüceyrə xətləri təsvir olunduğu kimi yaradılıb33,34,35.Bu hüceyrə xətləri orijinal BY-2 hüceyrə xətti üçün istifadə olunanlara bənzər prosedurlardan istifadə etməklə saxlanıla və sinxronlaşdırıla bilər.
HeLa hüceyrələri 5% CO2 ilə 37°C inkubatorda 10% fetal iribuynuzlu zərdab, 1.2 U/ml penisilin və 1.2 μq/ml streptomisin əlavə edilmiş Dulbecco-nun dəyişdirilmiş Eagle's mühitində (DMEM) (Life Technologies) becərildi.
Bu əlyazmada təsvir edilən bütün təcrübələr Yaponiyanın biotəhlükəsizlik qaydalarına və təlimatlarına uyğun olaraq həyata keçirilib.
Birləşmələr ehtiyat məhlulları kimi dimetil sulfoksiddə (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) həll edildi və Arabidopsis və tütün üçün MS mühitində və ya qaraciyər üçün Gamborg B5 mühitində seyreltildi.Kök böyüməsini maneə törətmə analizi üçün hər boşqab üçün 10-dan çox toxum göstərilən birləşmələri və ya DMSO-nu ehtiva edən agar mühitinə səpildi.Toxumlar 7 gün ərzində böyümə kamerasında inkubasiya edilmişdir.Fidanların fotoşəkilləri çəkildi və köklərin uzunluğu ölçüldü.Arabidopsis cücərmə analizi üçün hər boşqab üçün 48 toxum tərkibində 200 μM birləşmə və ya DMSO olan agar mühitinə səpildi.Arabidopsis toxumları böyümə kamerasında yetişdirilmiş və cücərdikdən (dağ) 7 gün sonra cücərmiş tinglərin sayı hesablanmışdır.Tütün cücərmə analizi üçün hər boşqab üçün 24 toxum tərkibində 200 μM KAND və ya DMSO olan agar mühitinə səpildi.Tütün toxumları böyümə kamerasında yetişdirilmiş və cücərmiş tinglərin sayı 14 gündən sonra hesablanmışdır.Qaraciyər bitkisinin böyüməsini maneə törətmə analizi üçün hər bir boşqabdan 9 embrion göstərilən KAND və ya DMSO konsentrasiyalarını ehtiva edən agar mühitinə qoyuldu və 14 gün ərzində böyümə kamerasında inkubasiya edildi.
Kök meristeminin təşkilini vizuallaşdırmaq üçün 5 mq/ml propidium yodid (PI) ilə boyanmış şitillərdən istifadə edin.PI siqnalları TCS SPE konfokal lazer tarama mikroskopundan (Leica Microsystems) istifadə edərək flüoresan mikroskopiya ilə müşahidə edildi.
Köklərin β-qlükuronidaza (GUS) ilə histokimyəvi boyanması Malami və Benfey36 tərəfindən təsvir edilən protokola uyğun olaraq aparılmışdır.Fidanlar bir gecədə 90% asetonda fiksasiya olundu, 1 saat ərzində GUS buferində 0,5 mq/ml 5-bromo-4-xloro-3-indolil-β-d-qlükuron turşusu ilə boyandı və hidratlı xloraldehid məhluluna yerləşdirildi.(8 q xloral hidrat, 2 ml su və 1 ml qliserin) və Axio Imager M1 mikroskopundan (Carl Zeiss) istifadə edərək diferensial müdaxilə kontrast mikroskopiyası ilə müşahidə edilir.
Kök bucaqları şaquli şəkildə yerləşdirilmiş lövhələrdə yetişdirilmiş 7 günlük fidanlarda ölçüldü.6-cı addımda təsvir olunduğu kimi kökün bucağını cazibə vektoru istiqamətindən ölçün.
Protokol 37-də kiçik dəyişikliklərlə təsvir edildiyi kimi kortikal mikrotubulların təşkili müşahidə edildi.Anti-β-tubulin antikoru (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) və Alexa Fluor 488 ilə birləşdirilmiş siçan əleyhinə IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) 1:1000 və 1:10 seyreltmə nisbətində əsas və ikincil antikorlar kimi istifadə edilmişdir. müvafiq olaraq.Floresan şəkilləri TCS SPE konfokal lazer skan edən mikroskopdan (Leica Microsystems) istifadə edərək əldə edilmişdir.Z-stack şəkillərini əldə edin və istehsalçının göstərişlərinə uyğun olaraq maksimum intensivlik proqnozları yaradın.
HeLa hüceyrə proliferasiyası təhlili istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Cell Counting Kit 8 (Dojindo) istifadə edərək həyata keçirilmişdir.
E. coli DH5α-nın böyüməsi 600 nm (OD600) spektrofotometrindən istifadə edərək mədəniyyətdə hüceyrə sıxlığının ölçülməsi ilə təhlil edilmişdir.
Transgenik BY-2 hüceyrələrində sitoskeletal quruluş CSU-X1 konfokal tarama cihazı (Yokogawa) və sCMOS kamerası (Zyla, Andor Technology) ilə təchiz edilmiş flüoresan mikroskopdan istifadə etməklə müşahidə edilmişdir.Sitoskeletal sıxlıq təsvir edildiyi kimi ImageJ proqram təminatından istifadə edərək konfokal şəkillərdə sitoplazmik piksellər arasında sitoskeletal piksellərin faizini müəyyən edən görüntü analizi ilə qiymətləndirilmişdir38,39.
BY-2 hüceyrələrində hüceyrə ölümünü aşkar etmək üçün hüceyrə suspenziyasının bir hissəsi otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində 0,05% Evans mavisi ilə inkubasiya edilmişdir.Ölü hüceyrələrin selektiv Evans mavi rənginə boyanması boyanın bütöv plazma membranı tərəfindən canlı hüceyrələrdən çıxarılmasından asılıdır40.Ləkələnmiş hüceyrələr parlaq sahə mikroskopundan (BX53, Olympus) istifadə edilməklə müşahidə edilmişdir.
HeLa hüceyrələri 37°C və 5% CO2-də nəmləndirilmiş inkubatorda 10% FBS ilə əlavə edilmiş DMEM-də yetişdirildi.Hüceyrələr 37°C-də 6 saat ərzində 100 μM KAND 11, kumamonamik turşu 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) və ya 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ilə müalicə olundu.Hüceyrələr otaq temperaturunda 10 dəqiqə MetOH, sonra isə 5 dəqiqə asetat ilə fiksasiya edilmişdir.Sabit hüceyrələr 2 saat ərzində 0,5% BSA/PBS-də seyreltilmiş β-tubulin əsas antikoru (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ilə inkubasiya edilmiş, 3 dəfə TBST ilə yuyulmuş və sonra Alexa Fluor keçi antikoru ilə inkubasiya edilmişdir.488 1 saat.– Siçan IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) və 0,5% BSA/PBS-də seyreltilmiş 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).TBST ilə üç dəfə yuyulduqdan sonra Nikon Eclipse Ti-E tərs mikroskopunda ləkələnmiş hüceyrələr müşahidə edildi.Şəkillər MetaMorph proqramından (Molekulyar Cihazlar) istifadə edərək soyudulmuş Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamera ilə çəkilmişdir.
Göndərmə vaxtı: 17 iyun 2024-cü il