Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzerin versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı nəticələr üçün brauzerinizin daha yeni versiyasından istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stil və ya JavaScript olmadan göstəririk.
Təbii məhsulların kəşfi və faydalı istifadəsi insan həyatının yaxşılaşdırılmasına kömək edə bilər. Bitki böyüməsini maneə törədən kimyəvi maddələr alaq otlarını nəzarətdə saxlamaq üçün herbisid kimi geniş istifadə olunur. Müxtəlif növ herbisidlərdən istifadə ehtiyacı səbəbindən yeni təsir mexanizmlərinə malik birləşmələrin müəyyən edilməsinə ehtiyac var. Bu tədqiqatda Streptomyces werraensis MK493-CF1-dən yeni bir N-alkoksipirrol birləşməsini, kumamonamid kəşf etdik və tam sintez prosesini qurduq. Bioloji aktivlik analizləri vasitəsilə urs-monoamidin sintetik aralıq məhsulu olduğunu və potensial...bitki böyümə inhibitoruBundan əlavə, HeLa hüceyrələrinin böyüməsinə mənfi təsir göstərmədən yüksək herbisid aktivliyinə malik olan urbeniloksi törəməsi (UDA) da daxil olmaqla müxtəlif urbenon turşusu törəmələri hazırlamışıq. Həmçinin, urmoton turşusu törəmələrinin bitki mikrotübüllərini pozduğunu aşkar etdik; bundan əlavə, KAND aktin filamentlərinə təsir göstərir və hüceyrə ölümünə səbəb olur; Bu çoxşaxəli təsirlər məlum mikrotübül inhibitorlarının təsirlərindən fərqlənir və urson turşusu üçün yeni bir təsir mexanizmi təklif edir ki, bu da yeni herbisidlərin hazırlanmasında mühüm üstünlük təşkil edir.
Faydalı təbii məhsulların və onların törəmələrinin kəşfi və praktik tətbiqi insan həyatının keyfiyyətini yaxşılaşdırmaq üçün bir vasitədir. Mikroorqanizmlər, bitkilər və həşəratlar tərəfindən istehsal olunan ikinci dərəcəli metabolitlər tibbdə və kənd təsərrüfatında böyük irəliləyişlərə səbəb olmuşdur. Təbii məhsullardan bir çox antibiotik və leykemiya əleyhinə dərmanlar hazırlanmışdır. Bundan əlavə, müxtəlif növlərpestisidlər, funqisidlər və herbisidlər kənd təsərrüfatında istifadə üçün bu təbii məhsullardan çıxarılır. Xüsusilə, alaq otlarına qarşı mübarizə herbisidləri müasir kənd təsərrüfatında məhsuldarlığı artırmaq üçün vacib vasitələrdir və müxtəlif növ birləşmələr artıq kommersiya məqsədləri üçün istifadə olunur. Bitkilərdə fotosintez, amin turşusu metabolizması, hüceyrə divarının sintezi, mitozun tənzimlənməsi, fitohormon siqnalizasiyası və ya zülal sintezi kimi bir neçə hüceyrə prosesi herbisidlərin tipik hədəfləri hesab olunur. Mikrotübül funksiyasını maneə törədən birləşmələr, mitotik tənzimləməyə təsir edərək bitki böyüməsinə təsir edən ümumi bir herbisid sinfidir2.
Mikrotübüllər sitoskeletin tərkib hissələridir və eukaryotik hüceyrələrdə geniş şəkildə qorunur. Tubulin heterodimeri α-tubulin və β-tubulindən ibarətdir və xətti mikrotübül protofilamentləri əmələ gətirir, 13 protofilament isə silindrik quruluş əmələ gətirir. Mikrotübüllər bitki hüceyrələrində hüceyrə formasını, hüceyrə bölünməsini və hüceyrədaxili nəqliyyatı təyin etmək də daxil olmaqla bir çox rol oynayır3,4. Bitki hüceyrələri interfazalı plazma membranının altında mikrotübüllər ehtiva edir və bu sözdə kortikal mikrotübüllərin sellüloza sintaz komplekslərinin tənzimlənməsi yolu ilə sellüloza mikrofibrillərinin təşkilini idarə etdiyi düşünülür4,5. Kök ucunun sürətli uzanma zonasında mövcud olan kök epidermal hüceyrələrinin kortikal mikrotübülləri yan tərəfdə yerləşir və sellüloza mikrofiberləri bu mikrotübülləri izləyir və hüceyrə genişlənməsinin istiqamətini məhdudlaşdırır və bununla da anizotrop hüceyrə uzanmasını təşviq edir. Buna görə də, mikrotübül funksiyası bitki morfologiyası ilə sıx bağlıdır. Tubulini kodlayan genlərdəki amin turşusu əvəzetmələri Arabidopsis-də kortikal mikrotübül massivlərinin əyriliyinə və sol və ya sağ tərəfli böyüməyə səbəb olur 6,7. Eynilə, mikrotübül dinamikasını tənzimləyən mikrotübüllə əlaqəli zülallardakı mutasiyalar da kök böyüməsinin pozulmasına səbəb ola bilər8,9,10,11,12,13. Bundan əlavə, pretilaxlor kimi də tanınan disopiramid kimi mikrotübülləri pozan herbisidlərlə müalicə də sol tərəfli oblik kök böyüməsinə səbəb olur14. Bu məlumatlar göstərir ki, mikrotübül funksiyasının dəqiq tənzimlənməsi bitki böyüməsinin istiqamətini müəyyən etmək üçün vacibdir.
Müxtəlif növ mikrotübül inhibitorları kəşf edilmişdir və bu dərmanlar sitoskelet tədqiqatlarına, eləcə də kənd təsərrüfatına və tibbə əhəmiyyətli töhfələr vermişdir2. Xüsusilə, oryzalin, dinitroanilin birləşmələri, disopiramid, benzamidlə əlaqəli birləşmələr və onların analoqları mikrotübül funksiyasını inhibə edə və bununla da bitki böyüməsini inhibə edə bilər. Buna görə də, onlar herbisid kimi geniş istifadə olunur. Lakin, mikrotübüllər bitki və heyvan hüceyrələrinin vacib bir komponenti olduğundan, əksər mikrotübül inhibitorları hər iki hüceyrə növü üçün sitotoksikdir. Buna görə də, herbisid kimi tanınmalarına baxmayaraq, praktik məqsədlər üçün məhdud sayda antimikrotübül agentlərindən istifadə olunur.
Streptomyces, aerob, qram-müsbət, filamentli bakteriyaları əhatə edən və geniş çeşiddə ikincili metabolitlər istehsal etmək qabiliyyəti ilə məşhur olan Streptomyces ailəsinə aid bir cinsidir. Buna görə də, o, yeni bioloji cəhətdən aktiv təbii məhsulların ən vacib mənbələrindən biri hesab olunur. Hazırkı tədqiqatda biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 və S. werraensis ISP 5486-dan təcrid olunmuş kumamonamid adlı yeni bir birləşmə kəşf etdik. Spektral analiz və tam spektral analizdən istifadə edərək kumamonamidin quruluşu xarakterizə edildi və onun unikal N-alkoksipirrol skeleti təyin edildi. sintezi. Urmon turşusu və onun törəmələrinin sintetik aralıq məhsulu olan urmon turşusunun məşhur model bitki Arabidopsis thaliana-nın böyüməsini və cücərməsini maneə törətdiyi aşkar edildi. Quruluş-aktivlik əlaqəsi tədqiqatında urson turşusuna modifikasiya edilmiş C9 ilə urson turşusunun noniloksi törəməsi (KAND) adlanan birləşmənin böyümə və cücərməyə inhibitor təsirini əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını aşkar etdik. Xüsusilə, yeni kəşf edilmiş bitki böyümə inhibitoru tütün və qaraciyər bitkisinin böyüməsinə də təsir etmiş və bakteriyalara və ya HeLa hüceyrələrinə sitotoksik təsir göstərməmişdir. Bundan əlavə, bəzi urmoton turşusu törəmələri təhrif olunmuş kök fenotipinə səbəb olur və bu törəmələrin birbaşa və ya dolayı yolla mikrotübüllərə təsir etdiyini göstərir. Bu fikrə uyğun olaraq, immunohistokimyəvi və ya flüoresan zülallarla etiketlənmiş mikrotübüllərin müşahidələrimiz KAND müalicəsinin mikrotübülləri depolimerləşdirdiyini göstərir. Bundan əlavə, kumamoton turşusu törəmələri ilə müalicə aktin mikrofilamentlərini pozmuşdur. Beləliklə, unikal təsir mexanizmi sitoskeletin məhv edilməsini əhatə edən yeni bir bitki böyümə inhibitoru kəşf etdik.
MK493-CF1 ştammı Tokionun Şinaqava-ku bölgəsində torpaqdan təcrid olunmuşdur. MK493-CF1 ştammı yaxşı budaqlanmış stromal miselyum əmələ gətirmişdir. 16S ribosomal RNT geninin qismən ardıcıllığı (1422 bp) müəyyən edilmişdir. Bu ştamm S. werraensis-ə çox oxşardır (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik ştamm, 99.93%). Bu nəticəyə əsasən, bu ştammın S. werraensis tipli ştammı ilə yaxından əlaqəli olduğu müəyyən edilmişdir. Buna görə də, biz bu ştammı müvəqqəti olaraq S. werraensis MK493-CF1 adlandırdıq. S. werraensis ISP 5486T də eyni bioaktiv birləşmələri istehsal edir. Bu mikroorqanizmdən təbii məhsulların alınması ilə bağlı erkən tədqiqatlar az olduğundan, əlavə kimyəvi tədqiqatlar aparılmışdır. S. werraensis MK493-CF1 arpa mühitində 30°C-də 14 gün ərzində bərk hal fermentasiyası yolu ilə becərildikdən sonra mühit 50% EtOH ilə ekstraksiya edildi. 59,5 mq xam ekstrakt əldə etmək üçün 60 ml nümunə quruduldu. Xam ekstrakt N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid (1, kumamonamid adlanır, 36,0 mq) əldə etmək üçün tərs fazalı HPLC-yə məruz qaldı. 1-in ümumi miqdarı xam ekstraktın təxminən 60%-ni təşkil edir. Buna görə də, kumamotoamidin 1 xüsusiyyətlərini ətraflı öyrənmək qərarına gəldik.
Kumamonamid 1 ağ amorf tozdur və yüksək dəqiqlikli kütlə spektrometriyası (HRESIMS) C6H8N2O2-ni təsdiqləyir (Şəkil 1). Bu birləşmənin C2 ilə əvəz olunmuş pirrol fraqmenti δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR spektrində: 4.5 Hz, H-5) və δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) ilə xarakterizə olunur və 13C NMR spektri dörd sp2 karbon atomunun mövcudluğunu göstərir. C2 mövqeyində amid qrupunun mövcudluğu δC 161.1-də C-3 protonundan amid karbonil karbonuna HMBC korrelyasiyası ilə qiymətləndirilmişdir. Bundan əlavə, δH 4.10 (3H, S) və δC 68.3-də 1 H və 13C NMR pikləri molekulda N-metoksi qruplarının mövcudluğunu göstərir. Metoksi qrupunun düzgün mövqeyi hələ gücləndirilmiş fərq spektroskopiyası və nüvə Overhauser qısaltması (NOEDF) kimi spektroskopik analizlərdən istifadə edilərək müəyyən edilməsə də, N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid ilk namizəd birləşmə oldu.
1-in düzgün quruluşunu təyin etmək üçün ümumi sintez aparıldı (Şəkil 2a). Ticarətdə mövcud olan 2-aminopiridin 2-nin m-CPBA ilə işlənməsi kəmiyyət baxımından müvafiq N-oksid 3 ilə nəticələndi. 2-nin 2-aminoazidləşməsindən sonra, Abramoviç tərəfindən təsvir edilən siklokondensasiya reaksiyası, istədiyiniz 1-hidroksi-1H-pirrol-2-karbonitril 5 qramla əldə etmək üçün 90°C-də benzolda aparıldı. Sürət 60% (iki mərhələ). 15,16. Daha sonra 4-ün metilləşməsi və hidrolizi yaxşı məhsuldarlıqla (70%, iki mərhələ) 1-metoksi-1H-pirrol-2-karbon turşusu ("kumoton turşusu" adlanır, 6) verdi. Nəhayət, sulu ammonyak istifadə edərək turşu xlorid aralıq məhsulu 6 vasitəsilə amidləşmə 98% məhsuldarlıqla Kumamoto amid 1 verdi. Sintez edilmiş 1-in bütün spektral məlumatları təcrid olunmuş 1-ə bənzəyirdi, buna görə də 1-in quruluşu təyin edildi;
Urbenamid və urben turşusunun bioloji aktivliyinin ümumi sintezi və təhlili. (a) Kumamoto amidinin ümumi sintezi. (b) Yeddi günlük vəhşi tipli Arabidopsis Columbia (Col) fidanları göstərilən konsentrasiyalarda kumamonamid 6 və ya kumamonamid 1 ehtiva edən Murashige və Skoog (MS) lövhələrində yetişdirilmişdir. Ölçü şkalası = 1 sm.
Əvvəlcə urbenamidin və onun aralıq məhsullarının bitki böyüməsini modulyasiya etmək qabiliyyətinə görə bioloji aktivliyini qiymətləndirdik. MS agar mühitinə müxtəlif konsentrasiyalarda urmonamid 1 və ya urmon turşusu 6 əlavə etdik və bu mühitdə Arabidopsis thaliana fidanlarını becərdik. Bu analizlər göstərdi ki, 6-nın yüksək konsentrasiyaları (500 μM) kök böyüməsini maneə törədir (Şəkil 2b). Daha sonra, 6-nın N1 mövqeyini əvəz etməklə müxtəlif törəmələr yaratdıq və onlar üzərində struktur-aktivlik əlaqəsi tədqiqatları apardıq (analoq sintez prosesi Əlavə Məlumatda (SI) təsvir edilmişdir). Arabidopsis fidanları 50 μM urson turşusu törəmələri olan bir mühitdə yetişdirildi və şəkildə göstərildiyi kimi kök uzunluğu ölçüldü. Şəkil 3a, b və S1-də göstərildiyi kimi, kumamo turşuları N1 mövqeyində müxtəlif uzunluqlu xətti alkoksi zəncirlərinə (9, 10, 11, 12 və 13) və ya böyük alkoksi zəncirlərinə (15, 16 və 17) malikdir. Törəmələri kök böyüməsinin əhəmiyyətli dərəcədə inhibə edilməsini göstərdi. Bundan əlavə, 200 μM 10, 11 və ya 17 tətbiqinin cücərməni maneə törətdiyini aşkar etdik (Şəkil 3c və S2).
Kumamoto amidinin və əlaqəli birləşmələrin struktur-aktivlik əlaqəsinin öyrənilməsi. (a) Analoqların strukturu və sintez sxemi. (b) 50 μM kumamonamid törəmələri ilə və ya olmadan MS mühitində yetişdirilən 7 günlük fidanların kök uzunluğunun kəmiyyətləndirilməsi. Ulduz işarələri saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (t testi, p<0.05). n>18. Məlumatlar orta ± SD kimi göstərilir. nt "sınaqdan keçirilməyib" deməkdir, çünki toxumların 50%-dən çoxu cücərməyib. (c) 200 μM kumamonamid və əlaqəli birləşmələrlə və ya onlarsız MS mühitində 7 gün inkubasiya edilmiş müalicə olunmuş toxumların cücərmə sürətinin kəmiyyətləndirilməsi. Ulduz işarələri saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (xi-kvadrat testi). n=96.
Maraqlıdır ki, C9-dan daha uzun alkil yan zəncirlərinin əlavə edilməsi inhibitor aktivliyi azaltdı və bu da kumamoot turşusu ilə əlaqəli birləşmələrin bioloji aktivliyini nümayiş etdirmək üçün müəyyən ölçülü yan zəncirlərə ehtiyac duyduğunu göstərir.
Struktur-aktivlik əlaqəsinin təhlili C9-un urson turşusuna çevrildiyini və urson turşusunun noniloksi törəməsinin (bundan sonra KAND 11 adlandırılacaq) ən təsirli bitki böyümə inhibitoru olduğunu göstərdiyindən, KAND 11-in daha ətraflı xarakteristikasını apardıq. Arabidopsis-in 50 μM KAND 11 ilə müalicəsi cücərmənin demək olar ki, tamamilə qarşısını aldı, KAND 11-in daha aşağı konsentrasiyaları (40, 30, 20 və ya 10 μM) isə kök böyüməsini dozadan asılı olaraq maneə törətdi (Şəkil 4a, b). KAND 11-in kök meristemasının canlılığına təsir edib-etmədiyini yoxlamaq üçün propidium yodid (PI) ilə boyanmış kök meristemalarını araşdırdıq və meristema sahəsinin ölçüsünü ölçdük. 25 μM KAND-11 tərkibli mühitdə yetişdirilən fidanların meristemasının ölçüsü 151,1 ± 32,5 μm, DMSO tərkibli nəzarət mühitində yetişdirilən fidanların meristemasının ölçüsü isə 264,7 ± 30,8 μm (Şəkil 4c, d) təşkil etmişdir ki, bu da KAND-11-in hüceyrə fəaliyyətini bərpa etdiyini göstərir. yayılma. Kök meristeması. Buna uyğun olaraq, KAND 11 müalicəsi kök meristemasında hüceyrə bölünmə markerinin CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS siqnalının miqdarını azaltmışdır (Şəkil 4e) 17. Bu nəticələr göstərir ki, KAND 11 hüceyrə proliferasiya fəaliyyətini azaltmaqla kök böyüməsini maneə törədir.
Urbenon turşusu törəmələrinin (urbeniloksi törəmələri) böyüməyə inhibitor təsirinin təhlili. (a) KAND 11-in göstərilən konsentrasiyaları ilə MS lövhələrində yetişdirilən 7 günlük vəhşi tipli Col fidanları. Miqyas zolağı = 1 sm. (b) Kök uzunluğunun kəmiyyətləndirilməsi. Hərflər əhəmiyyətli fərqləri göstərir (Tukey HSD testi, səh.<0.05). n>16. Məlumatlar orta ± SD kimi göstərilir. (c) 25 μM KAND ilə və ya onsuz MS lövhələrində yetişdirilən propidium yodidlə boyanmış vəhşi tipli Col köklərinin konfokal mikroskopiyası. 11. Ağ mötərizələr kök meristemasını göstərir. Miqyas zolağı = 100 µm. (d) Kök meristemasının ölçüsünün kəmiyyətləndirilməsi (n = 10-dan 11-ə qədər). Statistik fərqlər t-testi (p) istifadə edilərək müəyyən edilmişdir.< 0.05). Sütunlar orta meristemin ölçüsünü təmsil edir. (e) CDKB2 konstruksiyasını ehtiva edən kök meristemin diferensial interferensiya kontrastı (DIC) mikroskopiyası; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND analizi ilə və ya analizi olmadan MS lövhələrində yetişdirilən 5 günlük fidanlar üzərində 1-GUS boyanmış və rənglənmişdir.
KAND 11-in fitotoksikliyi başqa bir ikiotilli bitki olan tütün (Nicotiana tabacum) və əsas quru bitkisi model orqanizmi olan qaraciyər otu (Marchantia polymorpha) istifadə edilərək daha da sınaqdan keçirildi. Arabidopsisdə olduğu kimi, 25 μM KAND 11 ehtiva edən mühitdə yetişdirilən tütün SR-1 fidanları daha qısa köklər əmələ gətirdi (Şəkil 5a). Bundan əlavə, 48 toxumdan 40-ı 200 μM KAND 11 ehtiva edən lövhələrdə cücərdi, 48 toxumun hamısı isə sınaqdan keçirilmiş mühitdə cücərdi ki, bu da KAND-ın daha yüksək konsentrasiyalarının əhəmiyyətli olduğunu göstərir (s<0.05; chi testi -kvadrat) tütünün cücərməsini maneə törətdi. (Şəkil 5b). Bundan əlavə, qaraciyərdə bakteriyaların böyüməsini maneə törədən KAND 11-in konsentrasiyası Arabidopsisdəki effektiv konsentrasiyaya bənzəyirdi (Şəkil 5c). Bu nəticələr KAND 11-in müxtəlif bitkilərin böyüməsini maneə törədə biləcəyini göstərir. Daha sonra biz digər orqanizmlərdə, yəni insan HeLa hüceyrələrində və Escherichia coli ştammı DH5α-da ayı monoamidlə əlaqəli birləşmələrin mümkün sitotoksikliyini müvafiq olaraq daha yüksək heyvan və bakteriya hüceyrələrinin nümayəndələri kimi araşdırdıq. Bir sıra hüceyrə proliferasiya analizlərində biz müşahidə etdik ki, kumamonamid 1, kumamonamid turşusu 6 və KAND 11 100 μM konsentrasiyalarda HeLa və ya E. coli hüceyrələrinin böyüməsinə təsir göstərməyib (Şəkil 5d,e).
Arabidopsis olmayan orqanizmlərdə KAND 11-in böyüməsinin inhibə edilməsi. (a) İki həftəlik vəhşi tip SR-1 tütün fidanları 25 μM KAND 11 ehtiva edən şaquli yerləşdirilən MS lövhələrində yetişdirilmişdir. (b) İki həftəlik vəhşi tip SR-1 tütün fidanları 200 μM KAND 11 ehtiva edən üfüqi yerləşdirilən MS lövhələrində yetişdirilmişdir. (c) Göstərilən KAND 11 konsentrasiyaları ilə Gamborg B5 lövhələrində yetişdirilən iki həftəlik vəhşi tip Tak-1 qaraciyər qönçələri. Qırmızı oxlar iki həftəlik inkubasiya dövründə böyüməsini dayandıran sporları göstərir. (d) HeLa hüceyrələrinin hüceyrə proliferasiyası analizi. Canlı hüceyrələrin sayı hüceyrə sayma dəsti 8 (Dojindo) istifadə edərək sabit vaxt intervallarında ölçülmüşdür. Nəzarət olaraq, HeLa hüceyrələri RNT polimeraza transkripsiyasını inhibə edən və hüceyrə ölümünə səbəb olan 5 μq/ml aktinomisin D (D Aktı) ilə müalicə edilmişdir. Təhlillər üçqat aparılmışdır. (e) E. coli hüceyrə proliferasiyası analizi. E. coli böyüməsi OD600 ölçülməsi ilə təhlil edildi. Nəzarət qrupu olaraq, hüceyrələr bakteriya hüceyrə divarının sintezini inhibə edən 50 μq/ml ampisillin (Amp) ilə müalicə edildi. Təhlillər üçqat olaraq aparıldı.
Uramidlə əlaqəli birləşmələrin yaratdığı sitotoksikliyin təsir mexanizmini deşifrə etmək üçün, şəkildə göstərildiyi kimi, orta dərəcədə inhibitor təsirlərə malik urben turşusu törəmələrini yenidən təhlil etdik. Şəkil 2b, 6a-da göstərildiyi kimi, yüksək konsentrasiyalarda (200 μM) urmoton turşusu 6 olan aqar lövhələrində yetişdirilən fidanlar daha qısa və sola əyri köklər əmələ gətirdi (θ = – 23.7 ± 6.1), nəzarət mühitində yetişdirilən fidanların fidanları isə demək olar ki, düz köklər əmələ gətirdi (θ = – 3.8 ± 7.1). Bu xarakterik oblik böyümənin kortikal mikrotübüllərin disfunksiyasından qaynaqlandığı məlumdur14,18. Bu tapıntıya uyğun olaraq, mikrotübülləri qeyri-sabitləşdirən disopiramid və oryzalin preparatları böyümə şərtlərimizdə oxşar kök əyilməsinə səbəb oldu (Şəkil 2b, 6a). Eyni zamanda, urmoton turşusu törəmələrini sınaqdan keçirdik və müəyyən konsentrasiyalarda oblik kök böyüməsinə səbəb olan bir neçəsini seçdik. 8, 9 və 15 birləşmələri müvafiq olaraq 75 μM, 50 μM və 40 μM-də kök böyüməsinin istiqamətini dəyişdirdi ki, bu da bu birləşmələrin mikrotübülləri effektiv şəkildə poza biləcəyini göstərir (Şəkil 2b, 6a). Həmçinin ən güclü ursolik turşu törəməsi olan KAND 11-i daha aşağı konsentrasiyada (15 µM) sınaqdan keçirdik və KAND 11-in tətbiqinin kök böyüməsini maneə törətdiyini və kök böyüməsinin istiqamətinin qeyri-bərabər olduğunu, baxmayaraq ki, sola meylli olduqlarını aşkar etdik (Şəkil C3). Mikrotübülləri pozan dərmanların daha yüksək konsentrasiyaları bəzən kök əyilməsinə səbəb olmaq əvəzinə bitki böyüməsini maneə törətdiyindən, sonradan kök epidermal hüceyrələrində kortikal mikrotübülləri müşahidə edərək KAND 11-in mikrotübüllərə təsir etmə ehtimalını qiymətləndirdik. 25 μM KAND 11 ilə müalicə olunmuş fidan köklərinin epidermal hüceyrələrində anti-β-tubulin antikorlarından istifadə edərək immunohistokimya, elongasiya zonasında epidermal hüceyrələrdə demək olar ki, bütün kortikal mikrotübüllərin yox olduğunu göstərdi (Şəkil 6b). Bu nəticələr göstərir ki, kumamoton turşusu və onun törəmələri mikrotübüllərə birbaşa və ya dolayı yolla təsir edərək onları pozur və bu birləşmələr yeni mikrotübül inhibitorlarıdır.
Urson turşusu və onun törəmələri Arabidopsis thaliana bitkisində kortikal mikrotübülləri dəyişdirir. (a) Göstərilən konsentrasiyalarda müxtəlif urmoton turşusu törəmələrinin iştirakı ilə ölçülən kök meyl bucağı. Mikrotübülləri inhibə etdiyi bilinən iki birləşmənin: disopiramid və oryzalinin təsirləri də təhlil edilmişdir. Əlavədə kök böyümə bucağını ölçmək üçün istifadə olunan standart göstərilir. Ulduz işarələri saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (t testi, p<0.05). n>19. Ölçü zolağı = 1 sm. (b) Uzanma zonasındakı epidermal hüceyrələrdə kortikal mikrotübüllər. 25 μM KAND 11 ilə və ya olmadan MS lövhələrində yetişdirilən vəhşi tip Arabidopsis Col köklərindəki mikrotübüllər β-tubulin ilkin antikorları və Alexa Fluor ilə birləşdirilmiş ikincil antikorlar istifadə edərək immunohistokimyəvi boyama ilə vizuallaşdırıldı. Ölçü zolağı = 10 μm. (c) Kök meristemasındakı mikrotübüllərin mitotik quruluşu. Mikrotübüllər immunohistokimyəvi boyama ilə vizuallaşdırıldı. Profaza zonaları, millər və fraqmoplastlar da daxil olmaqla mitotik strukturlar konfokal görüntülərdən sayıldı. Oxlar mitotik mikrotübül strukturlarını göstərir. Ulduz işarələri saxta müalicə ilə əhəmiyyətli fərqləri göstərir (t testi, p<0.05). n>9. Ölçü zolağı = 50 µm.
Ursa mikrotübül funksiyasını pozmaq qabiliyyətinə malik olsa da, onun təsir mexanizminin tipik mikrotübül depolimerləşdirici maddələrdən fərqli olması gözlənilir. Məsələn, disopiramid və oryzalin kimi mikrotübül depolimerləşdirici maddələrin daha yüksək konsentrasiyaları epidermal hüceyrələrin anizotrop genişlənməsinə səbəb olur, KAND 11 isə belə etmir. Bundan əlavə, KAND 11 və disopiramidin birgə tətbiqi disopiramidlə induksiya edilmiş kök böyümə reaksiyasına və KAND 11 ilə induksiya edilmiş böyümə inhibisiyasına səbəb olmuşdur (Şəkil S4). Həmçinin, hiperhəssas disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantının KAND 11-ə qarşı reaksiyasını təhlil etdik. phs1-1 qeyri-kanonik tubulin kinaz nöqtəsi mutasiyasına malikdir və disopiramid9,20 ilə müalicə edildikdə daha qısa köklər əmələ gətirir. KAND 11 ehtiva edən aqar mühitində yetişdirilən phs1-1 mutant fidanları disopiramidlə yetişdirilənlərə bənzər daha qısa köklərə malik idi (şəkil S5).
Bundan əlavə, KAND 11 ilə müalicə olunmuş fidanların kök meristemasında profaza zonaları, mili və fraqmoplastlar kimi mitotik mikrotübül strukturlarını müşahidə etdik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS üçün müşahidələrə uyğun olaraq, mitotik mikrotübüllərin sayında əhəmiyyətli dərəcədə azalma müşahidə edildi (Şəkil .6c).
KAND 11-in subhüceyrəvi həllində sitotoksikliyini xarakterizə etmək üçün tütün BY-2 suspenziya hüceyrələrini KAND 11 ilə müalicə etdik və onların reaksiyasını müşahidə etdik. KAND 11-in kortikal mikrotübüllərə təsirini qiymətləndirmək üçün əvvəlcə mikrotübülləri flüoresan şəkildə etiketləyən TagRFP-TUA6 ifadə edən BY-2 hüceyrələrinə KAND 11 əlavə etdik. Kortikal mikrotübül sıxlığı sitoplazmatik piksellər arasında sitoskeletal piksellərin faizini ölçən görüntü analizi istifadə edilərək qiymətləndirildi. Təhlil nəticələri göstərdi ki, 1 saat ərzində 50 μM və ya 100 μM KAND 11 ilə müalicədən sonra sıxlıq əhəmiyyətli dərəcədə azalaraq müvafiq olaraq 0,94 ± 0,74% və ya 0,23 ± 0,28%-ə enib, DMSO ilə müalicə olunan hüceyrələrin sıxlığı isə 1,61 ± 0,34% təşkil edib (Şəkil 7a). Bu nəticələr Arabidopsis-də KAND 11 müalicəsinin kortikal mikrotübüllərin depolimerləşməsinə səbəb olduğu müşahidəsi ilə uyğun gəlir (Şəkil 6b). Həmçinin, eyni konsentrasiyalı KAND 11 ilə müalicədən sonra GFP-ABD ilə işarələnmiş aktin filamentləri olan BY-2 xəttini araşdırdıq və KAND 11 müalicəsinin aktin filamentlərini pozduğunu müşahidə etdik. 1 saat ərzində 50 μM və ya 100 μM KAND 11 ilə müalicə aktin filament sıxlığını müvafiq olaraq 1,20 ± 0,62% və ya 0,61 ± 0,26%-ə qədər əhəmiyyətli dərəcədə azaltdı, DMSO ilə müalicə olunmuş hüceyrələrdə sıxlıq isə 1,69 ± 0,51% idi (Şəkil 2). 7b). Bu nəticələr aktin filamentlərinə təsir etməyən propizamidin və mikrotübüllərə təsir etməyən aktin depolimerizatoru olan latrunkulin B-nin təsirləri ilə ziddiyyət təşkil edir (SI Şəkil S6). Bundan əlavə, kumamonamid 1, kumamonamid turşusu 6 və ya KAND 11 ilə müalicə HeLa hüceyrələrindəki mikrotübüllərə təsir göstərməmişdir (SI Şəkil S7). Beləliklə, KAND 11-in təsir mexanizminin məlum sitoskelet pozucularından fərqli olduğuna inanılır. Bundan əlavə, KAND 11 ilə müalicə olunan BY-2 hüceyrələrinin mikroskopik müşahidəsi KAND 11 müalicəsi zamanı hüceyrə ölümünün başladığını aşkar etdi və Evans mavi ləkəli ölü hüceyrələrin nisbətinin KAND 11 müalicəsinin 30 dəqiqəsindən sonra əhəmiyyətli dərəcədə artmadığını, 50 μM və ya 100 μM KAND ilə 90 dəqiqəlik müalicədən sonra isə ölü hüceyrələrin sayının müvafiq olaraq 43,7% və ya 80,1%-ə qədər artdığını göstərdi (Şəkil 7c). Ümumilikdə, bu məlumatlar yeni ursolik turşu törəməsi KAND 11-in əvvəllər məlum olmayan təsir mexanizminə malik bitkiyə xas sitoskelet inhibitoru olduğunu göstərir.
KAND, tütün BY-2 hüceyrələrinin kortikal mikrotübüllərinə, aktin filamentlərinə və canlılığına təsir göstərir. (a) TagRFP-TUA6 iştirakı ilə BY-2 hüceyrələrində kortikal mikrotübüllərin vizuallaşdırılması. KAND 11 (50 μM və ya 100 μM) və ya DMSO ilə müalicə olunmuş BY-2 hüceyrələri konfokal mikroskopiya ilə müayinə edilmişdir. Kortikal mikrotübül sıxlığı 25 müstəqil hüceyrənin mikroqraflarından hesablanmışdır. Hərflər əhəmiyyətli fərqləri göstərir (Tukey HSD testi, səh.< 0.05). Ölçü zolağı = 10 µm. (b) GFP-ABD2 iştirakı ilə görüntülənən BY-2 hüceyrələrindəki kortikal aktin filamentləri. KAND 11 (50 μM və ya 100 μM) və ya DMSO ilə müalicə olunmuş BY-2 hüceyrələri konfokal mikroskopiya ilə müayinə edildi. Kortikal aktin filamentlərinin sıxlığı 25 müstəqil hüceyrənin mikroqraflarından hesablanmışdır. Hərflər əhəmiyyətli fərqləri göstərir (Tukey HSD testi, səh.< 0.05). Ölçü zolağı = 10 µm. (c) Evans mavi boyama ilə ölü BY-2 hüceyrələrinin müşahidəsi. KAND 11 (50 µM və ya 100 µM) və ya DMSO ilə müalicə olunmuş BY-2 hüceyrələri parlaq sahəli mikroskopiya ilə müayinə edildi. n=3. Ölçü zolağı = 100 µm.
Yeni təbii məhsulların kəşfi və tətbiqi insan həyatının müxtəlif sahələrində, o cümlədən tibb və kənd təsərrüfatında əhəmiyyətli irəliləyişlərə səbəb olmuşdur. Təbii ehtiyatlardan faydalı birləşmələrin əldə edilməsi üçün tarixi tədqiqatlar aparılmışdır. Xüsusilə, aktinomisetlərin nematodlar üçün parazit əleyhinə antibiotik kimi faydalı olduğu məlumdur, çünki onlar ivermektinin aparıcı birləşməsi olan avermektin və bleomisin və onun törəmələri kimi müxtəlif ikinci dərəcəli metabolitlər istehsal etmək qabiliyyətinə malikdirlər və bu metabolitlər xərçəng əleyhinə vasitə kimi tibbi məqsədlər üçün istifadə olunur21,22. Eynilə, aktinomisetlərdən müxtəlif herbisid birləşmələri aşkar edilmişdir ki, onlardan bəziləri artıq kommersiya məqsədləri üçün istifadə olunur1,23. Buna görə də, istənilən bioloji aktivliyə malik təbii məhsulları təcrid etmək üçün aktinomiset metabolitlərinin təhlili effektiv strategiya hesab olunur. Bu tədqiqatda biz S. werraensis-dən yeni bir birləşmə olan kumamonamid kəşf etdik və onu uğurla sintez etdik. Urson turşusu urbenamidin və onun törəmələrinin sintetik ara məhsuludur. O, xarakterik kök qıvrılmasına səbəb ola bilər, orta və ya güclü herbisid aktivliyi nümayiş etdirə bilər və bitki mikrotübüllərinə birbaşa və ya dolayı yolla zərər verə bilər. Lakin, urmoton turşusunun təsir mexanizmi mövcud mikrotübül inhibitorlarının təsir mexanizmindən fərqlənə bilər, çünki KAND 11 həmçinin aktin filamentlərini pozur və hüceyrə ölümünə səbəb olur ki, bu da urmoton turşusunun və onun törəmələrinin geniş sitoskelet strukturlarına təsir etdiyi tənzimləyici mexanizmi göstərir.
Urbenon turşusunun daha ətraflı xarakteristikası urbenon turşusunun təsir mexanizmini daha yaxşı başa düşməyə kömək edəcək. Xüsusilə, növbəti məqsəd urson turşusunun reduksiya olunmuş mikrotübüllərə bağlanma qabiliyyətini qiymətləndirmək və urson turşusunun və onun törəmələrinin birbaşa mikrotübüllərə təsir edib-etmədiyini və ya onların təsirinin mikrotübüllərin qeyri-sabitləşməsinə səbəb olub-olmadığını müəyyən etməkdir. Bundan əlavə, mikrotübüllərin birbaşa hədəf olmadığı halda, urson turşusunun bitki hüceyrələrində təsir yerini və molekulyar hədəflərini müəyyən etmək əlaqəli birləşmələrin xüsusiyyətlərini və herbisid aktivliyini artırmağın mümkün yollarını daha yaxşı başa düşməyə kömək edəcəkdir. Bioaktivlik analizimiz urson turşusunun Arabidopsis thaliana, tütün və qaraciyər otları kimi bitkilərin böyüməsinə unikal sitotoksik qabiliyyətini aşkar etdi, halbuki nə E. coli, nə də HeLa hüceyrələri təsirlənməmişdir. Urson turşusu törəmələri açıq kənd təsərrüfatı sahələrində istifadə üçün herbisid kimi hazırlanırsa, heyvan hüceyrələri üçün az və ya heç bir toksiklik yoxdur. Həqiqətən də, mikrotübüllər eukaryotlarda ümumi strukturlar olduğundan, bitkilərdə onların selektiv inhibisyonu herbisidlər üçün əsas tələbdir. Məsələn, birbaşa tubulinə bağlanan və polimerləşməni inhibə edən mikrotübül depolimerləşdirici agent olan propizamid, heyvan hüceyrələri üçün aşağı toksikliyə malik olduğuna görə herbisid kimi istifadə olunur24. Disopiramiddən fərqli olaraq, əlaqəli benzamidlər fərqli hədəf spesifikliyinə malikdir. Bitki mikrotübüllərinə əlavə olaraq, RH-4032 və ya benzoksamid də müvafiq olaraq heyvan hüceyrələrinin və ya oomitsetlərin mikrotübüllərini inhibə edir və zalilamid aşağı fitotoksikliyə malik olduğuna görə funqisid kimi istifadə olunur25,26,27. Yeni kəşf edilmiş ayı və onun törəmələri bitkilərə qarşı selektiv sitotoksiklik nümayiş etdirir, lakin qeyd etmək lazımdır ki, əlavə modifikasiyalar onların hədəf spesifikliyini dəyişdirə bilər və potensial olaraq patogen göbələklərin və ya oomitsetlərin idarə olunması üçün əlavə törəmələr təmin edə bilər.
Urbenon turşusunun və onun törəmələrinin unikal xüsusiyyətləri onların herbisid kimi inkişafı və tədqiqat vasitələri kimi istifadəsi üçün faydalıdır. Bitki hüceyrəsinin formasının idarə olunmasında sitoskeletonun əhəmiyyəti geniş şəkildə tanınır. Əvvəlki tədqiqatlar göstərir ki, bitkilər morfogenezi düzgün şəkildə idarə etmək üçün mikrotübül dinamikasını idarə etməklə kortikal mikrotübül təşkilinin mürəkkəb mexanizmlərini inkişaf etdiriblər. Mikrotübül aktivliyinin tənzimlənməsindən məsul olan çox sayda molekul müəyyən edilib və əlaqəli tədqiqatlar hələ də davam edir3,4,28. Bitki hüceyrələrində mikrotübül dinamikası haqqında hazırkı anlayışımız kortikal mikrotübül təşkilinin mexanizmlərini tam izah etmir. Məsələn, həm disopiramid, həm də oryzalin mikrotübülləri depolimerləşdirə bilsə də, disopiramid kökün ciddi şəkildə deformasiyasına səbəb olur, oryzalin isə nisbətən mülayim təsir göstərir. Bundan əlavə, mikrotübülləri sabitləşdirən tubulindəki mutasiyalar köklərdə dekstrorotasiyaya da səbəb olur, mikrotübül dinamikasını da sabitləşdirən paklitaksel isə belə etmir. Buna görə də, ursolik turşunun molekulyar hədəflərinin öyrənilməsi və müəyyən edilməsi bitki kortikal mikrotübüllərinin tənzimlənməsi ilə bağlı yeni məlumatlar verməlidir. Eynilə, disopiramid kimi təhrif olunmuş böyüməni təşviq etməkdə təsirli olan kimyəvi maddələrin və oryzalin və ya kumamotor turşusu kimi daha az təsirli kimyəvi maddələrin gələcək müqayisələri təhrif olunmuş böyümənin necə baş verdiyinə dair ipucları verəcəkdir.
Digər tərəfdən, müdafiə ilə əlaqəli sitoskelet dəyişiklikləri urson turşusunun sitotoksikliyini izah etmək üçün başqa bir imkandır. Patogenin infeksiyası və ya bitki hüceyrələrinə eksitorun daxil edilməsi bəzən sitoskeletin məhv olmasına və sonradan hüceyrə ölümünə səbəb olur29. Məsələn, oomisetdən əldə edilən kriptoksantinin KAND müalicəsi ilə baş verənlərə bənzər şəkildə tütün hüceyrə ölümündən əvvəl mikrotübülləri və aktin filamentlərini pozduğu bildirilir30,31. Urson turşusu tərəfindən induksiya edilən müdafiə reaksiyaları ilə hüceyrə reaksiyaları arasındakı oxşarlıqlar, onların ümumi hüceyrə proseslərini tetiklediyi fərziyyəsini irəli sürməyə vadar etdi, baxmayaraq ki, urson turşusunun kriptoksantindən daha sürətli və güclü təsiri göz qabağındadır. Lakin, tədqiqatlar göstərir ki, aktin filamentlərinin pozulması spontan hüceyrə ölümünə səbəb olur ki, bu da həmişə mikrotübüllərin pozulması ilə müşayiət olunmur29. Bundan əlavə, urson turşusu törəmələri kimi patogenin və ya eksitorun təhrif olunmuş kök böyüməsinə səbəb olub-olmadığı hələ məlum deyil. Beləliklə, müdafiə reaksiyalarını və sitoskeletini əlaqələndirən molekulyar biliklər həll edilməli cəlbedici bir problemdir. Urson turşusu ilə əlaqəli aşağı molekulyar çəkili birləşmələrin, eləcə də müxtəlif potensiala malik bir sıra törəmələrin mövcudluğundan istifadə etməklə, onlar naməlum hüceyrə mexanizmlərini hədəf almaq üçün imkanlar yarada bilərlər.
Ümumilikdə, mikrotübül dinamikasını modulyasiya edən yeni birləşmələrin kəşfi və tətbiqi bitki hüceyrəsinin formasının təyin edilməsinin əsasını təşkil edən mürəkkəb molekulyar mexanizmləri həll etmək üçün güclü metodlar təmin edəcəkdir. Bu kontekstdə, mikrotübüllərə və aktin filamentlərinə təsir edən və hüceyrə ölümünə səbəb olan bu yaxınlarda hazırlanmış urmoton turşusu birləşmə mikrotübül nəzarəti ilə bu digər mexanizmlər arasındakı əlaqəni deşifrə etmək üçün fürsət yarada bilər. Beləliklə, urbenon turşusundan istifadə edərək kimyəvi və bioloji analiz bitki sitoskeletini idarə edən molekulyar tənzimləyici mexanizmləri anlamağımıza kömək edəcəkdir.
S. werraensis MK493-CF1-i 2% (w/v) qalaktoza, 2% (w/v) Essensiya pastası, 1% (w/v) Bacto tərkibli 110 ml toxum mühiti olan 500 ml qarışıq Erlenmeyer kolbasına inokulyasiya edin. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) qarğıdalı ekstraktı (KOGOSTCH Co., Ltd., Yaponiya), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 və 0.2% CaCO3 deionlaşdırılmış suda (sterilizasiyadan əvvəl pH 7.4). Toxum kulturaları 27°C-də 2 gün ərzində fırlanan çalkalayıcıda (180 dövr/dəq) inkubasiya edildi. İstehsal bərk hal fermentasiyası yolu ilə becərildi. Toxum kulturası (7 ml) 15 q preslənmiş arpa (MUSO Co., Ltd., Yaponiya) və 25 q deionlaşdırılmış sudan (sterilizasiyadan əvvəl pH tənzimlənməmiş) ibarət 40 q istehsal mühiti olan 500 ml K-1 kolbasına köçürüldü. Fermentasiya 14 gün ərzində qaranlıqda 30°C-də aparıldı. Fermentasiya materialı 40 ml/şüşə EtOH ilə ekstraksiya edildi və santrifüj edildi (1500 q, 4°C, 10 dəq). Kultura supernatantı (60 ml) 10% MeOH/EtOAc qarışığı ilə ekstraksiya edildi. Üzvi təbəqə aşağı təzyiq altında buxarlanaraq qalıq (59,5 mq) əldə edildi və bu qalıq əks fazalı sütunda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × uzunluq 250 mm) qradiyentli elusiya ilə (0–10 dəqiqə: 90%) HPLC-yə məruz qaldı (10–35 dəqiqə): 90% H2O/CH3CN-dən 70% H2O/CH3CN-ə (qradiyent), 35–45 dəqiqə: 90% H2O/EtOH, 45–155 dəqiqə: 90% H2O/EtOH-dan 100% EtOH-a (qradiyent (qradiyent), 155–200 dəq: 100% EtOH) 1,5 ml/dəq axın sürətində, kumamonamid (1,36,0 mq) ağ amorf toz kimi təcrid edildi.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hesablanmış dəyər: 141.0659, ölçülmüş dəyər: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 sm–1.
Kolumbiya toxumları (Col-0) tədqiqat istifadəsi üçün icazə ilə Arabidopsis Bioloji Resurs Mərkəzindən (ABRC) əldə edilmişdir. Col-0 toxumları laboratoriya şəraitimizdə çoxaldılmış və saxlanılmış, vəhşi tip Arabidopsis bitkiləri kimi istifadə edilmişdir. Arabidopsis toxumları səthi sterilizasiya edilmiş və 2% saxaroza (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etansulfon turşusu (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) və 1,5% aqar (Fujifilm Wako Pure Chemical) olan yarım möhkəmlikli Murashige və Skoog mühitində, pH 5,7-də, 23 °C-də və sabit işıqda becərilmişdir. phs1-1 mutantının toxumları T. Haşimoto (Nara Elm və Texnologiya İnstitutu) tərəfindən təmin edilmişdir.
SR-1 ştammının toxumları T. Haşimoto (Nara Elm və Texnologiya İnstitutu) tərəfindən təmin edilmiş və vəhşi tipli tütün bitkiləri kimi istifadə edilmişdir. Tütün toxumları səthi sterilizasiya edilmiş və cücərməsini təşviq etmək üçün üç gecə steril suda isladılmış, sonra pH 5.7 olan 2% saxaroza, 0.05% (w/v) MES və 0.8% gellan saqqızı (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige və Skoog mühiti) tərkibli yarım möhkəmlikli məhlula yerləşdirilmiş və 23°C-də sabit işıq altında inkubasiya edilmişdir.
Tak-1 ştammı T. Kohçi (Kyoto Universiteti) tərəfindən təmin edilmiş və qaraciyər otunun tədqiqi üçün standart təcrübə vahidi kimi istifadə edilmişdir. Gemma sterilizasiya olunmuş becərilən bitkilərdən əldə edilmiş və sonra 1% saxaroza və 0,3% gellan saqqızı olan Gamborg B5 mühitinə (Fujifilm Wako Pure Chemical) örtülmüş və 23°C-də davamlı işıq altında inkubasiya edilmişdir.
Tütün BY-2 hüceyrələri (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokio Universiteti) tərəfindən təmin edilmişdir. BY-2 hüceyrələri modifikasiya olunmuş Linsmeier və Skoog mühitində 95 dəfə durulaşdırılmış və həftəlik olaraq 2,4-dixlorfenoksisirkə turşusu ilə əlavə edilmişdir 32 . Hüceyrə suspenziyası qaranlıqda 27°C-də 130 dövr/dəqiqədə fırlanan çalkalayıcıda qarışdırılmışdır. Hüceyrələri təzə mühitin həcminin 10 qatı ilə yuyun və eyni mühitdə yenidən suspenziya edin. Gül kələmi mozaika virusu 35S promotoru altında mikrotübül marker TagRFP-TUA6 və ya aktin filament marker GFP-ABD2-ni sabit şəkildə ifadə edən BY-2 transgen hüceyrə xətləri təsvir edildiyi kimi yaradılmışdır 33, 34, 35. Bu hüceyrə xətləri orijinal BY-2 hüceyrə xətti üçün istifadə edilən prosedurlara bənzər prosedurlardan istifadə etməklə saxlanıla və sinxronlaşdırıla bilər.
HeLa hüceyrələri, 37°C temperaturda 5% CO2 ilə inkubatorda 10% döl mal-qara serumu, 1,2 U/ml penisilin və 1,2 μq/ml streptomisin əlavə edilmiş Dulbecco modifikasiya edilmiş Eagle mühitində (DMEM) (Life Technologies) becərildi.
Bu əlyazmada təsvir edilən bütün təcrübələr Yaponiyanın biotəhlükəsizlik qaydalarına və təlimatlarına uyğun olaraq aparılmışdır.
Birləşmələr dimetil sulfoksiddə (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ehtiyat məhlulları kimi həll edildi və Arabidopsis və tütün üçün MS mühitində, qaraciyər üçün isə Gamborg B5 mühitində durulaşdırıldı. Kök böyüməsinin qarşısının alınması analizi üçün hər boşqaba 10-dan çox toxum göstərilən birləşmələri və ya DMSO ehtiva edən aqar mühitinə səpildi. Toxumlar böyümə kamerasında 7 gün inkubasiya edildi. Fidanların şəkli çəkildi və köklərin uzunluğu ölçüldü. Arabidopsis cücərmə analizi üçün hər boşqaba 48 toxum 200 μM birləşmə və ya DMSO ehtiva edən aqar mühitinə səpildi. Arabidopsis toxumları böyümə kamerasında yetişdirildi və cücərmiş fidanların sayı cücərmədən 7 gün sonra (dag) sayıldı. Tütün cücərmə analizi üçün hər boşqaba 24 toxum 200 μM KAND və ya DMSO ehtiva edən aqar mühitinə səpildi. Tütün toxumları böyümə kamerasında yetişdirildi və 14 gündən sonra cücərmiş fidanların sayı sayıldı. Qaraciyər otunun böyüməsinin qarşısının alınması analizi üçün hər lövhədən 9 embrion, göstərilən KAND və ya DMSO konsentrasiyalarını ehtiva edən aqar mühitinə yerləşdirildi və böyümə kamerasında 14 gün inkubasiya edildi.
Kök meristemasının təşkilini vizuallaşdırmaq üçün 5 mq/ml propidium yodid (PI) ilə boyanmış fidanlardan istifadə edin. PI siqnalları TCS SPE konfokal lazer skanlama mikroskopu (Leica Microsystems) istifadə edərək flüoresans mikroskopiyası ilə müşahidə edildi.
Köklərin β-qlükuronidaza (GUS) ilə histokimyəvi boyanması Malami və Benfey36 tərəfindən təsvir edilən protokola uyğun olaraq aparılmışdır. Fidanlar bir gecə ərzində 90% asetonda fiksasiya edilmiş, 1 saat ərzində GUS buferində 0,5 mq/ml 5-bromo-4-xlor-3-indolil-β-d-qlükuronik turşu ilə boyanmış və hidratlı xloraldehid məhluluna (8 q xloral hidrat, 2 ml su və 1 ml qliserin) qoyulmuş və Axio Imager M1 mikroskopu (Carl Zeiss) istifadə edərək diferensial interferensiya kontrast mikroskopiyası ilə müşahidə edilmişdir.
Kök bucaqları şaquli şəkildə yerləşdirilmiş lövhələrdə yetişdirilən 7 günlük fidanlarda ölçüldü. 6-cı addımda təsvir edildiyi kimi, kök bucağını cazibə vektorunun istiqamətindən ölçün.
Kortikal mikrotübüllərin düzülüşü təsvir edildiyi kimi müşahidə edildi, protokolda kiçik dəyişikliklər edildi 37. Anti-β-tubulin antikoru (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) və Alexa Fluor 488 ilə birləşdirilmiş siçan əleyhinə IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) müvafiq olaraq 1:1000 və 1:100 seyreltmələrdə birincili və ikincili antikorlar kimi istifadə edildi. Flüoresans görüntüləri TCS SPE konfokal lazer skanlama mikroskopu (Leica Microsystems) istifadə edilərək əldə edildi. Z-yığın görüntülərini əldə edin və istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq maksimum intensivlik proyeksiyaları yaradın.
HeLa hüceyrə proliferasiyası analizi istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq Hüceyrə Sayma Dəsti 8 (Dojindo) istifadə edilərək aparılmışdır.
E. coli DH5α-nın böyüməsi, 600 nm (OD600) spektrofotometrindən istifadə edərək kulturada hüceyrə sıxlığını ölçməklə təhlil edilmişdir.
Transgen BY-2 hüceyrələrində sitoskeletin təşkili CSU-X1 konfokal skan cihazı (Yokogawa) və sCMOS kamerası (Zyla, Andor Technology) ilə təchiz olunmuş flüoresans mikroskopu istifadə edilərək müşahidə edilmişdir. Sitoskeletin sıxlığı təsvir edildiyi kimi ImageJ proqram təminatından istifadə edərək konfokal şəkillərdəki sitoplazmatik piksellər arasında sitoskeletin piksellərinin faizini ölçən təsvir təhlili ilə qiymətləndirilmişdir38,39.
BY-2 hüceyrələrində hüceyrə ölümünü aşkar etmək üçün hüceyrə suspenziyasının bir hissəsi otaq temperaturunda 10 dəqiqə ərzində 0,05% Evans mavisi ilə inkubasiya edildi. Ölü hüceyrələrin selektiv Evans mavisi ilə boyanması, boyanın canlı hüceyrələrdən bütöv plazma membranı tərəfindən ifraz olunmasından asılıdır40. Boyalı hüceyrələr parlaq sahəli mikroskop (BX53, Olympus) istifadə edilərək müşahidə edildi.
HeLa hüceyrələri 37°C və 5% CO2-də nəmləndirilmiş inkubatorda 10% FBS ilə zənginləşdirilmiş DMEM-də yetişdirildi. Hüceyrələr 37°C-də 6 saat ərzində 100 μM KAND 11, kumamonam turşusu 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) və ya 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ilə müalicə edildi. Hüceyrələr otaq temperaturunda 10 dəqiqə MetOH ilə, sonra isə 5 dəqiqə asetatla fiksasiya edildi. Fiksasiya edilmiş hüceyrələr 0,5% BSA/PBS-də seyreltilmiş β-tubulin ilkin antikoru (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ilə 2 saat inkubasiya edildi, 3 dəfə TBST ilə yuyuldu və sonra Alexa Fluor keçi antikoru ilə inkubasiya edildi. 488 1 saat. – Siçan IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) və 0,5% BSA/PBS-də durulaşdırılmış 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). TBST ilə üç dəfə yuyulduqdan sonra, boyanmış hüceyrələr Nikon Eclipse Ti-E tərs mikroskopunda müşahidə edildi. Şəkillər MetaMorph proqram təminatından (Molecular Devices) istifadə edərək soyudulmuş Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerası ilə çəkildi.
Yazı vaxtı: 17 iyun 2024