Sürgün apikal meristeminin (SAM) böyüməsi kök arxitekturası üçün vacibdir. Bitki hormonlarıgibberellinlər(GA) bitki artımının əlaqələndirilməsində əsas rol oynayır, lakin onların SAM-dakı rolu hələ də zəif başa düşülür. Burada biz DELLA zülalının GA-nın tanınması zamanı deqradasiyasını qoruyarkən onun GA transkripsiya cavabında əsas tənzimləyici funksiyasını boğmaq üçün mühəndislik yolu ilə GA siqnalının ratsional metrik biosensorunu hazırladıq. Biz nümayiş etdiririk ki, bu deqradasiyaya əsaslanan biosensor inkişaf zamanı GA səviyyələrində və hüceyrə sensorunda dəyişiklikləri dəqiq qeyd edir. Biz bu biosensordan SAM-da GA siqnal fəaliyyətini xəritələşdirmək üçün istifadə etdik. Biz göstəririk ki, yüksək GA siqnalları, əsasən, internode hüceyrələrin prekursorları olan orqan primordiyaları arasında yerləşən hüceyrələrdə mövcuddur. Qazanma və funksiya itkisi yanaşmalarından istifadə edərək, GA-nın hüceyrə bölünmə müstəvisinin oriyentasiyasını tənzimlədiyini, internodların kanonik hüceyrə təşkilini qurduğunu və bununla da SAM-da internode spesifikasiyasını təşviq etdiyini nümayiş etdiririk.
Sürgün zirvəsində yerləşən tumurcuq apikal meristemində (SAM) bitkinin həyatı boyu modul və iterativ şəkildə yanal orqanlar və kök düyünləri əmələ gətirən kök hüceyrə yuvası var. Bu təkrarlanan vahidlərin və ya bitki düyünlərinin hər birinə düyünlərdə internodlar və yan orqanlar, yarpaq axillərində isə qoltuqaltı meristemlər daxildir1. Bitki düyünlərinin böyüməsi və təşkili inkişaf zamanı dəyişir. Arabidopsisdə vegetativ mərhələdə düyünlərarası böyümə yatırılır və rozet yarpaqlarının qoltuqlarında aksiller meristemlər hərəkətsiz qalır. Çiçək fazasına keçid zamanı SAM inflorescence meristem olur, uzunsov düyünlərarası və qoltuq qönçələri, gül yarpaqlarının qoltuqlarında budaqlar, daha sonra isə yarpaqsız çiçəklər əmələ gətirir2. Yarpaqların, çiçəklərin və budaqların başlanğıcını idarə edən mexanizmləri başa düşməkdə əhəmiyyətli irəliləyiş əldə etsək də, internodların necə yarandığı haqqında nisbətən az şey məlumdur.
GA-ların məkan-zaman paylanmasının başa düşülməsi bu hormonların müxtəlif toxumalarda və müxtəlif inkişaf mərhələlərində funksiyalarını daha yaxşı başa düşməyə kömək edəcəkdir. Öz promotorunun təsiri altında ifadə edilən RGA-GFP birləşməsinin deqradasiyasının vizuallaşdırılması köklərdə ümumi GA səviyyələrinin tənzimlənməsi haqqında mühüm məlumat verir15,16. Bununla belə, RGA ifadəsi toxumalar arasında dəyişir17 və GA18 tərəfindən tənzimlənir. Beləliklə, RGA promotorunun diferensial ifadəsi RGA-GFP ilə müşahidə olunan flüoresan nümunəsi ilə nəticələnə bilər və buna görə də bu üsul kəmiyyət deyil. Bu yaxınlarda bioaktiv flüoresein (Fl) etiketli GA19,20 GA-nın kök endokorteksində yığılmasını və onun hüceyrə səviyyələrinin GA nəqli ilə tənzimlənməsini aşkar etdi. Bu yaxınlarda GA FRET sensoru nlsGPS1 göstərdi ki, GA səviyyələri köklərdə, filamentlərdə və tündləşmiş hipokotillərdə21 hüceyrə uzanması ilə korrelyasiya olunur. Bununla belə, gördüyümüz kimi, GA konsentrasiyası GA siqnal fəaliyyətini idarə edən yeganə parametr deyil, çünki o, mürəkkəb algılama proseslərindən asılıdır. Burada, DELLA və GA siqnal yolları haqqında anlayışımıza əsaslanaraq, GA siqnalizasiyası üçün deqradasiyaya əsaslanan nisbi metrik biosensorun inkişafı və xarakteristikasını təqdim edirik. Bu kəmiyyət biosensorunu inkişaf etdirmək üçün biz flüoresan zülala birləşdirilən və toxumalarda hər yerdə ifadə olunan mutant GA-həssas RGA-dan, həmçinin GA-həssas olmayan flüoresan zülaldan istifadə etdik. Biz göstəririk ki, mutant RGA zülal birləşmələri hər yerdə ifadə olunduqda endogen GA siqnalına mane olmur və bu biosensor yüksək məkan-zaman ayırdetmə qabiliyyətinə malik sensor aparatları tərəfindən həm GA girişi, həm də GA siqnalının işlənməsi nəticəsində yaranan siqnal fəaliyyətini kəmiyyətcə qiymətləndirə bilir. Biz bu biosensordan GA siqnal fəaliyyətinin məkan-zaman paylanmasını xəritələşdirmək və GA-nın SAM epidermisində hüceyrə davranışını necə tənzimlədiyini ölçmək üçün istifadə etdik. Nümayiş edirik ki, GA orqan primordiyaları arasında yerləşən SAM hüceyrələrinin bölünmə müstəvisinin istiqamətini tənzimləyir və bununla da internodun kanonik hüceyrə təşkilini müəyyənləşdirir.
Nəhayət, qmRGA-nın artan hipokotillərdən istifadə edərək endogen GA səviyyələrində dəyişiklikləri bildirə biləcəyini soruşduq. Biz əvvəllər göstərmişdik ki, nitrat GA sintezini və öz növbəsində DELLA34 deqradasiyasını artırmaqla böyüməyi stimullaşdırır. Müvafiq olaraq, bol nitrat tədarükü (10 mM NO3−) altında yetişdirilən pUBQ10::qmRGA fidanlarında hipokotil uzunluğunun nitrat çatışmazlığı olan şəraitdə yetişdirilən fidanlardan əhəmiyyətli dərəcədə uzun olduğunu müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 6a). Böyümə reaksiyasına uyğun olaraq, 10 mM NO3− şəraitində yetişdirilən şitillərin hipokotillərində GA siqnalları nitrat olmadıqda yetişdirilən fidanlara nisbətən daha yüksək idi (Əlavə Şəkil 6b, c). Beləliklə, qmRGA həm də GA konsentrasiyasında endogen dəyişikliklərin səbəb olduğu GA siqnalında dəyişikliklərin monitorinqinə imkan verir.
QmRGA tərəfindən aşkar edilən GA siqnal fəaliyyətinin GA konsentrasiyası və GA qavrayışından asılı olub olmadığını anlamaq üçün, sensor dizaynı əsasında gözlənildiyi kimi, vegetativ və reproduktiv toxumalarda üç GID1 reseptorunun ifadəsini təhlil etdik. Fidanlarda GID1-GUS müxbir xətti GID1a və c-nin kotiledonlarda yüksək ifadə edildiyini göstərdi (Şəkil 3a-c). Bundan əlavə, hər üç reseptor yarpaqlarda, yanal kök primordiyasında, kök uclarında (GID1b-nin kök qapağından başqa) və damar sistemində (Şəkil 3a-c) ifadə edilmişdir. Çiçəklənmə SAM-da biz yalnız GID1b və 1c üçün GUS siqnallarını aşkar etdik (Əlavə Şəkil 7a-c). In situ hibridləşdirmə bu ifadə nümunələrini təsdiqlədi və daha sonra GID1c-nin SAM-da aşağı səviyyələrdə bərabər şəkildə ifadə edildiyini, GID1b isə SAM-ın periferiyasında daha yüksək ifadə göstərdiyini nümayiş etdirdi (Əlavə Şəkil 7d-l). pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b translyasiya sintezi həmçinin SAM mərkəzində aşağı və ya heç bir ifadədən orqan sərhədlərində yüksək ifadəyə qədər GID1b ifadəsinin pilləli diapazonunu aşkar etdi (Əlavə Şəkil 7m). Beləliklə, GID1 reseptorları toxumalar arasında və daxilində bərabər paylanmır. Sonrakı təcrübələrdə biz də müşahidə etdik ki, GID1-in həddindən artıq ifadəsi (pUBQ10::GID1a-mCherry) hipokotillərdə qmRGA-nın xarici GA tətbiqinə həssaslığını artırdı (Şəkil 3d, e). Bunun əksinə olaraq, hipokotildə qd17mRGA ilə ölçülən flüoresan GA3 müalicəsinə qarşı həssas idi (Şəkil 3f, g). GID1 reseptoruna bağlanma qabiliyyətinin gücləndiyi və ya itirildiyi sensorun sürətli davranışını qiymətləndirmək üçün hər iki analiz üçün şitillər yüksək konsentrasiyalı GA (100 μM GA3) ilə müalicə olundu. Birlikdə, bu nəticələr qmRGA biosensorunun GA və GA sensoru kimi birləşmiş funksiyaya xidmət etdiyini təsdiqləyir və GID1 reseptorunun diferensial ifadəsinin sensorun emissiyasını əhəmiyyətli dərəcədə modullaşdıra biləcəyini göstərir.
Bu günə qədər SAM-da GA siqnallarının paylanması qeyri-müəyyən olaraq qalır. Buna görə də, L1 təbəqəsinə (epidermis; Şəkil 4a, b, Metodlara və Əlavə Metodlara baxın) fokuslanaraq GA siqnal fəaliyyətinin yüksək rezolyusiyalı kəmiyyət xəritələrini hesablamaq üçün qmRGA ifadə edən bitkilərdən və pCLV3::mCherry-NLS kök hüceyrə reportyorundan35 istifadə etdik. Burada, pCLV3::mCherry-NLS ifadəsi GA siqnal fəaliyyətinin məkan-zaman paylanmasını təhlil etmək üçün sabit həndəsi istinad nöqtəsini təmin etdi37. GA yanal orqan inkişafı üçün vacib hesab edilsə də4, biz müşahidə etdik ki, GA siqnalları P3 mərhələsindən başlayaraq çiçəkli primordiumda (P) aşağı idi (Şəkil 4a, b), halbuki gənc P1 və P2 primordiumları mərkəzi bölgədəkinə bənzər orta aktivliyə malik idi (Şəkil 4a, b). Daha yüksək GA siqnal aktivliyi orqanın primordium sərhədlərində, P1/P2-dən başlayaraq (sərhədin kənarlarında) və P4-də pik nöqtəsində, həmçinin primordiya arasında yerləşən periferik bölgənin bütün hüceyrələrində aşkar edilmişdir (Şəkil 4a, b və Əlavə Şəkil 8a, b). Bu yüksək GA siqnal aktivliyi təkcə epidermisdə deyil, həm də L2 və yuxarı L3 təbəqələrində müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 8b). QmRGA istifadə edərək SAM-da aşkar edilən GA siqnallarının nümunəsi də zamanla dəyişməz qaldı (Əlavə Şəkil 8c-f, k). Qd17mRGA konstruksiyası T3 bitkilərinin SAM-də ətraflı şəkildə xarakterizə etdiyimiz beş müstəqil xəttdən sistematik olaraq aşağı salınsa da, biz pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP konstruksiya ilə əldə edilmiş flüoresan nümunələri təhlil edə bildik (Əlavə Şəkil 8g-j, l). Bu nəzarət xəttində SAM-da flüoresan nisbətində yalnız kiçik dəyişikliklər aşkar edildi, lakin SAM mərkəzində biz TagBFP ilə əlaqəli VENUS-da aydın və gözlənilməz azalma müşahidə etdik. Bu, qmRGA tərəfindən müşahidə edilən siqnal modelinin mRGA-VENUS-un GA-dan asılı deqradasiyasını əks etdirdiyini təsdiqləyir, həm də qmRGA-nın meristem mərkəzində GA siqnal fəaliyyətini həddindən artıq qiymətləndirə biləcəyini nümayiş etdirir. Xülasə, nəticələrimiz ilk növbədə primordia paylanmasını əks etdirən GA siqnal modelini ortaya qoyur. Primordiumlararası bölgənin (İPR) bu paylanması inkişaf edən primordium və mərkəzi bölgə arasında yüksək GA siqnal fəaliyyətinin tədricən qurulması ilə əlaqədardır, eyni zamanda primordiumda GA siqnal aktivliyi azalır (şəkil 4c, d).
GID1b və GID1c reseptorlarının paylanması (yuxarıya bax) GA reseptorlarının diferensial ifadəsinin SAM-da GA siqnal fəaliyyətinin modelini formalaşdırmağa kömək etdiyini göstərir. GA-nın diferensial yığılmasının iştirak edib-etmədiyini merak etdik. Bu ehtimalı araşdırmaq üçün biz nlsGPS1 GA FRET sensor21-dən istifadə etdik. 100 dəqiqə ərzində 10 μM GA4+7 ilə müalicə olunan nlsGPS1-in SAM-da artan aktivasiya tezliyi aşkar edildi (Əlavə Şəkil 9a-e), bu da nlsGPS1-in köklərdə olduğu kimi SAM-da GA konsentrasiyasındakı dəyişikliklərə cavab verdiyini göstərir21. NlsGPS1 aktivasiya tezliyinin məkan paylanması SAM-ın xarici təbəqələrində nisbətən aşağı GA səviyyələrini aşkar etdi, lakin onların SAM-ın mərkəzində və sərhədlərində yüksəldiyini göstərdi (Şəkil 4e və Əlavə Şəkil 9a, c). Bu, GA-nın SAM-da qmRGA tərəfindən aşkar edilənlə müqayisə edilə bilən məkan nümunəsi ilə də paylandığını göstərir. Tamamlayıcı bir yanaşma olaraq, biz SAM-ı flüoresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) və ya Fl ilə tək başına mənfi nəzarət kimi müalicə etdik. Fl siqnalı daha az intensivlikdə olsa da, mərkəzi bölgə və primordium daxil olmaqla SAM-da paylandı (Şəkil 4j və Əlavə Şəkil 10d). Bunun əksinə olaraq, hər üç GA-Fl xüsusi olaraq primordium sərhədləri daxilində və İPR-nin qalan hissəsində müxtəlif dərəcələrdə toplanmışdır, GA7-Fl isə İPR-də ən böyük domendə toplanır (Şəkil 4k və Əlavə Şəkil 10a,b). Flüoresans intensivliyinin kəmiyyəti müəyyən etdi ki, GA-Fl ilə işlənmiş SAM-da Fl ilə işlənmiş SAM ilə müqayisədə İPR ilə qeyri-İPR intensivlik nisbəti daha yüksəkdir (Şəkil 4l və Əlavə Şəkil 10c). Birlikdə, bu nəticələr orqan sərhədinə ən yaxın olan İPR hüceyrələrində GA-nın daha yüksək konsentrasiyalarda olduğunu göstərir. Bu, SAM GA siqnal fəaliyyətinin modelinin həm GA reseptorlarının diferensial ifadəsi, həm də orqan sərhədləri yaxınlığında İPR hüceyrələrində GA-nın diferensial yığılması nəticəsində yarandığını göstərir. Beləliklə, təhlilimiz SAM-ın mərkəzində və primordiumunda daha aşağı aktivlik və periferik bölgədə İPR-də daha yüksək aktivlik ilə GA siqnalının gözlənilməz məkan-zaman modelini aşkar etdi.
SAM-da diferensial GA siqnal fəaliyyətinin rolunu başa düşmək üçün biz SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-in real vaxt fasiləsiz görüntüləməsindən istifadə edərək GA siqnal fəaliyyəti, hüceyrə genişlənməsi və hüceyrə bölünməsi arasındakı əlaqəni təhlil etdik. GA-nın böyümənin tənzimlənməsindəki rolunu nəzərə alaraq, hüceyrə genişlənmə parametrləri ilə müsbət korrelyasiya gözlənilirdi. Buna görə də, biz əvvəlcə GA siqnal fəaliyyəti xəritələrini hüceyrə səthinin böyümə sürətinin xəritələri ilə (müəyyən bir hüceyrə üçün və bölünmə zamanı hüceyrə genişlənməsinin gücü üçün bir proksi olaraq) və hüceyrə genişlənməsinin istiqamətini ölçən böyümə anizotropiya xəritələri ilə müqayisə etdik (həmçinin burada müəyyən bir hüceyrə və bölünmə zamanı qız hüceyrələr üçün istifadə olunur; Şəkil 5a, Metod və Əlavələrə baxın). SAM hüceyrə səthinin böyümə sürəti xəritələrimiz əvvəlki müşahidələrə38,39 uyğundur, sərhəddə minimal artım templəri və inkişaf edən çiçəklərdə maksimal artım templəri ilə (Şəkil 5a). Əsas komponent təhlili (PCA) göstərdi ki, GA siqnal fəaliyyəti hüceyrə səthinin böyümə intensivliyi ilə mənfi korrelyasiya olunur (Şəkil 5c). GA siqnal girişi və böyümə intensivliyi də daxil olmaqla əsas dəyişkənlik oxlarının yüksək CLV3 ifadəsi ilə müəyyən edilmiş istiqamətə ortoqonal olduğunu, qalan analizlərdə hüceyrələrin SAM mərkəzindən xaric edilməsini təsdiqlədiyini göstərdik. Spearman korrelyasiya təhlili PCA nəticələrini təsdiqlədi (Şəkil 5d), IPR-də daha yüksək GA siqnallarının daha yüksək hüceyrə genişlənməsi ilə nəticələnmədiyini göstərir. Bununla belə, korrelyasiya təhlili GA siqnal fəaliyyəti ilə böyümə anizotropiyası arasında bir qədər müsbət korrelyasiya aşkar etdi (Şəkil 5c, d), IPR-də daha yüksək GA siqnalının hüceyrə böyüməsinin istiqamətinə və bəlkə də hüceyrə bölünməsi müstəvisinin mövqeyinə təsir etdiyini göstərir.
a, b SAM-da orta səth artımının (a) və böyümə anizotropiyasının (b) istilik xəritələri yeddi müstəqil bitki üzərində orta hesabla (müvafiq olaraq, hüceyrə genişlənməsinin gücü və istiqaməti üçün proksi kimi istifadə olunur). c PCA təhlili aşağıdakı dəyişənləri əhatə etdi: GA siqnalı, səth artımının intensivliyi, səth artımı anizotropiyası və CLV3 ifadəsi. PCA komponenti 1 əsasən səth artım intensivliyi ilə mənfi korrelyasiya və GA siqnalı ilə müsbət korrelyasiya edilmişdir. PCA komponenti 2 əsasən səth artımı anizotropiyası ilə müsbət və CLV3 ifadəsi ilə mənfi korrelyasiya edilmişdir. Faizlər hər bir komponent tərəfindən izah edilən dəyişikliyi təmsil edir. d CZ istisna olmaqla, toxuma miqyasında GA siqnalı, səth artım intensivliyi və səth artımı anizotropiyası arasında Spearman korrelyasiya təhlili. Sağdakı rəqəm iki dəyişən arasındakı Spearman rho dəyəridir. Ulduz işarələri korrelyasiya/mənfi əlaqənin yüksək əhəmiyyətli olduğu halları göstərir. e Col-0 SAM L1 hüceyrələrinin konfokal mikroskopiya ilə 3D vizuallaşdırılması. 10 saatda SAM-da (lakin primordiumda deyil) əmələ gələn yeni hüceyrə divarları bucaq dəyərlərinə görə rənglənir. Rəng çubuğu aşağı sağ küncdə göstərilir. Daxil 0 saatda müvafiq 3D təsviri göstərir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. f Qutu sahələri IPR və qeyri-İPR Col-0 SAM-da hüceyrə bölünmə dərəcələrini göstərir (n = 10 müstəqil bitki). Mərkəzi xətt medianı, qutunun sərhədləri isə 25-ci və 75-ci persentilləri göstərir. Bığlar R proqramı ilə müəyyən edilmiş minimum və maksimum dəyərləri göstərir. P dəyərləri Welch'in iki quyruqlu t-testi ilə əldə edilmişdir. g, h (g) yeni hüceyrə divarının (magenta) bucağının SAM mərkəzindən radial istiqamətə (ağ nöqtəli xətt) görə necə ölçüləcəyini göstərən sxematik diaqram (yalnız kəskin bucaq qiymətləri, yəni 0–90° nəzərə alınır) və (h) meristem daxilində çevrə/yanal və radial istiqamətlər. i müvafiq olaraq SAM (tünd göy), IPR (orta mavi) və qeyri-IPR (açıq mavi) üzrə hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasının tezlik histoqramları. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov testi ilə əldə edilmişdir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. j Müvafiq olaraq P3 (açıq yaşıl), P4 (orta yaşıl) və P5 (tünd yaşıl) ətrafında İPR-nin hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasının tezlik histoqramları. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov testi ilə əldə edilmişdir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı.
Buna görə də, biz daha sonra analiz zamanı yeni əmələ gələn hüceyrə divarlarını müəyyən etməklə GA siqnalı ilə hüceyrə bölünməsi fəaliyyəti arasındakı əlaqəni araşdırdıq (Şəkil 5e). Bu yanaşma hüceyrə bölünməsinin tezliyini və istiqamətini ölçməyə imkan verdi. Təəccüblüdür ki, biz İPR-də və qalan SAM-da (qeyri-IPR, Şəkil 5f) hüceyrə bölmələrinin tezliyinin oxşar olduğunu aşkar etdik, bu, IPR və qeyri-IPR hüceyrələri arasında GA siqnalındakı fərqlərin hüceyrə bölünməsinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir etmədiyini göstərir. Bu və GA siqnalı ilə böyümə anizotropiyası arasındakı müsbət korrelyasiya bizi GA siqnal fəaliyyətinin hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasına təsir edə biləcəyini düşünməyə vadar etdi. Yeni hüceyrə divarının oriyentasiyasını meristem mərkəzini və yeni hüceyrə divarının mərkəzini birləşdirən radial oxa nisbətən kəskin bucaq kimi ölçdük (Şəkil 5e-i) və hüceyrələrin radial oxa nisbətən 90 ° -ə yaxın bucaqlarda bölünməsi üçün aydın bir tendensiya müşahidə etdik, ən yüksək tezliklər 70-80 ° 8 və 70-80 ° -də müşahidə edildi. (22.62%) (Şəkil 5e, i), çevrəvi / eninə istiqamətdə hüceyrə bölmələrinə uyğundur (Şəkil 5h). GA siqnalının bu hüceyrə bölünməsi davranışına verdiyi töhfəni araşdırmaq üçün biz İPR və qeyri-İPR-də hüceyrə bölünməsi parametrlərini ayrı-ayrılıqda təhlil etdik (Şəkil 5i). Müşahidə etdik ki, İPR hüceyrələrində bölünmə bucağı paylanması qeyri-İPR hüceyrələrində və ya bütün SAM-dakı hüceyrələrdəkindən fərqlənir, İPR hüceyrələri daha yüksək nisbətdə yanal/dairəvi hüceyrə bölgüsü nümayiş etdirir, yəni 70-80° və 80-90° (müvafiq olaraq 33.86% və 30.71%, Fig.5). Beləliklə, müşahidələrimiz yüksək GA siqnalı ilə GA siqnal fəaliyyəti ilə böyümə anizotropiyası arasındakı korrelyasiyaya bənzər çevrə istiqamətinə yaxın bir hüceyrə bölünməsi təyyarəsi oriyentasiyası arasında bir əlaqəni ortaya qoydu (Şəkil 5c, d). Bu assosiasiyanın məkan mühafizəsini daha da qurmaq üçün biz P3-dən başlayaraq primordiumu əhatə edən İPR hüceyrələrində bölünmə müstəvisinin oriyentasiyasını ölçdük, çünki bu bölgədə P4-dən başlayaraq ən yüksək GA siqnal aktivliyi aşkar edilmişdir (Şəkil 4). P3 və P4 ətrafında İPR-nin bölünmə bucaqları statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqlər göstərməmişdir, baxmayaraq ki, P4 ətrafında İPR-də yanal hüceyrə bölmələrinin artması tezliyi müşahidə edilmişdir (Şəkil 5j). Bununla belə, P5 ətrafında olan İPR hüceyrələrində hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasındakı fərq statistik əhəmiyyət kəsb edir, transvers hüceyrə bölmələrinin tezliyində kəskin artım müşahidə olunur (şək. 5j). Birlikdə, bu nəticələr GA siqnalının SAM-da hüceyrə bölmələrinin oriyentasiyasını idarə edə biləcəyini göstərir ki, bu da əvvəlki hesabatlara uyğundur40,41 yüksək GA siqnalının İPR-də hüceyrə bölmələrinin yanal oriyentasiyasına səbəb ola bilər.
İPR-dəki hüceyrələrin primordiyaya deyil, internodlara daxil ediləcəyi proqnozlaşdırılır2,42,43. İPR-də hüceyrə bölmələrinin eninə istiqaməti internodlarda epidermal hüceyrələrin paralel uzununa sıralarının tipik təşkili ilə nəticələnə bilər. Yuxarıda təsvir edilən müşahidələrimiz göstərir ki, GA siqnalizasiyası hüceyrə bölünməsinin istiqamətini tənzimləməklə bu prosesdə çox güman ki, rol oynayır.
Bir neçə DELLA geninin funksiyasının itirilməsi konstitutiv GA reaksiyası ilə nəticələnir və della mutantları bu fərziyyəni yoxlamaq üçün istifadə edilə bilər44. Əvvəlcə SAM-da beş DELLA geninin ifadə nümunələrini təhlil etdik. GUS xəttinin45 transkripsiya birləşməsi GAI, RGA, RGL1 və RGL2-nin (daha az dərəcədə) SAM-da ifadə edildiyini aşkar etdi (Əlavə Şəkil 11a-d). Yerində hibridləşmə daha sonra GAI mRNT-nin xüsusi olaraq primordia və inkişaf edən çiçəklərdə toplandığını nümayiş etdirdi (Əlavə Şəkil 11e). RGL1 və RGL3 mRNA SAM örtüyü boyunca və köhnə çiçəklərdə aşkar edildi, halbuki RGL2 mRNA sərhəd bölgəsində daha çox idi (Əlavə Şəkil 11f-h). pRGL3 :: RGL3-GFP SAM-ın konfokal görüntülənməsi in situ hibridləşmə ilə müşahidə edilən ifadəni təsdiqlədi və RGL3 zülalının SAM-ın mərkəzi hissəsində toplandığını göstərdi (Əlavə Şəkil 11i). pRGA::GFP-RGA xəttini istifadə edərək, biz RGA proteininin SAM-da toplandığını, lakin onun bolluğunun P4-dən başlayaraq sərhəddə azaldığını tapdıq (Əlavə Şəkil 11j). Xüsusilə, RGL3 və RGA ifadə nümunələri qmRGA tərəfindən aşkar edildiyi kimi, IPR-də daha yüksək GA siqnal aktivliyinə uyğundur (Şəkil 4). Bundan əlavə, bu məlumatlar göstərir ki, bütün DELLA-lar SAM-da ifadə olunur və onların ifadəsi birlikdə bütün SAM-ı əhatə edir.
Daha sonra vəhşi tipli SAM (Ler, nəzarət) və gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beşlik (qlobal) mutantlarda hüceyrə bölünməsi parametrlərini təhlil etdik (Şəkil 6a, b). Maraqlıdır ki, biz vəhşi tiplə müqayisədə della qlobal mutant SAM-da hüceyrə bölgüsü bucağı tezliklərinin paylanmasında statistik əhəmiyyətli dəyişiklik müşahidə etdik (Şəkil 6c). Della qlobal mutantında bu dəyişiklik 80-90° bucaqların (34.71% -ə qarşı 24.55%) və daha az dərəcədə 70-80° bucaqların (23.78% -ə qarşı 20.18%) artması, yəni transvers hüceyrə bölmələrinə uyğun olması ilə əlaqədar idi (Şəkil 6c). Transvers olmayan bölmələrin tezliyi (0-60 °) della qlobal mutantda da aşağı idi (Şəkil 6c). Eninə hüceyrə bölmələrinin tezliyi della qlobal mutantın SAM-da əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 6b). İPR-də transvers hüceyrə bölmələrinin tezliyi də vəhşi tiplə müqayisədə della qlobal mutantda daha yüksək idi (Şəkil 6d). İPR bölgəsindən kənarda vəhşi tip hüceyrə bölünmə bucaqlarının daha vahid paylanmasına malik idi, halbuki della qlobal mutant IPR kimi tangensial bölmələrə üstünlük verirdi (Şəkil 6e). Biz həmçinin GA-nın toplandığı GA-qeyri-aktiv mutant fonu olan ga2 oksidaz (ga2ox) beşlik mutantlarının (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 və ga2ox6-2) SAM-da hüceyrə bölmələrinin oriyentasiyasını kəmiyyətcə qiymətləndirdik. GA səviyyələrinin artmasına uyğun olaraq, beşli ga2ox mutant çiçəklənmənin SAM-ı Col-0-dan daha böyük idi (Əlavə Şəkil 12a, b) və Col-0 ilə müqayisədə, beşli ga2ox SAM, hüceyrə bölünməsi bucaqlarının açıq şəkildə fərqli paylanmasını göstərdi, bucaq 0-dan yenidən 5 ° 0-a yüksəldi. bölmələr (Əlavə Şəkil 12a–c). Beləliklə, biz göstəririk ki, GA siqnalının konstitusiya aktivləşdirilməsi və GA yığılması IPR-də və SAM-ın qalan hissəsində yanal hüceyrə bölünməsinə səbəb olur.
a, b Konfokal mikroskopiyadan istifadə edərək PI ilə boyanmış Ler (a) və qlobal della mutant (b) SAM-ın L1 təbəqəsinin 3D vizuallaşdırılması. 10 saat ərzində SAM-da əmələ gələn yeni hüceyrə divarları (lakin primordium deyil) bucaq dəyərlərinə uyğun olaraq göstərilir və rənglənir. Daxil SAM-ı 0 saatda göstərir. Rəng çubuğu aşağı sağ küncdə göstərilir. (b)-dəki ox qlobal della mutantında uyğunlaşdırılmış hüceyrə faylları nümunəsinə işarə edir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. ce Ler və qlobal della arasında bütün SAM (d), IPR (e) və qeyri-IPR (f) üzrə hüceyrə bölünməsi müstəvisi istiqamətlərinin tezlik paylanmasının müqayisəsi. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov testindən istifadə edərək əldə edilmişdir. f, g Col-0 (i) və pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgenik bitkilərin PI ilə boyanmış SAM-nın konfokal şəkillərinin 3D vizuallaşdırılması. Panellər (a, b) 10 saat ərzində SAM-da əmələ gələn yeni hüceyrə divarlarını (lakin primordia deyil) göstərir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. h–j Col-0 və pCUC2::gai-1-VENUS bitkiləri arasında bütün SAM (h), IPR (i) və qeyri-IPR (j)-də yerləşən hüceyrə bölünməsi müstəvisi istiqamətlərinin tezlik paylanmasının müqayisəsi. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov testindən istifadə edərək əldə edilmişdir.
Biz daha sonra xüsusi olaraq IPR-də GA siqnalının qarşısının alınmasının təsirini sınaqdan keçirdik. Bu məqsədlə biz VENUSA (pCUC2::gai-1-VENUS xəttində) birləşmiş dominant mənfi gai-1 zülalının ifadəsini idarə etmək üçün kotiledon kuboku 2 (CUC2) promotorundan istifadə etdik. Vəhşi tipli SAM-da CUC2 promotoru P4-dən başlayaraq sərhəd hüceyrələri də daxil olmaqla, SAM-da əksər İPR-lərin ifadəsini idarə edir və oxşar spesifik ifadə pCUC2::gai-1-VENUS bitkilərində müşahidə edilmişdir (aşağıya bax). pCUC2::gai-1-VENUS bitkilərinin SAM və ya İPR üzrə hüceyrə bölünmə bucaqlarının paylanması vəhşi tipdən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmədi, baxmayaraq ki, gözlənilmədən bu bitkilərdə İPR olmayan hüceyrələrin 80-90° daha yüksək tezlikdə bölündüyünü aşkar etdik (Şəkil 6f-j).
Hüceyrə bölünməsinin istiqamətinin SAM-ın həndəsəsindən, xüsusən də toxuma əyriliyinin yaratdığı gərginlikdən asılı olduğu irəli sürülüb46. Buna görə də biz SAM-ın formasının della qlobal mutant və pCUC2::gai-1-VENUS bitkilərində dəyişib-dəyişmədiyini soruşduq. Daha əvvəl bildirildiyi kimi12, della qlobal mutant SAM-ın ölçüsü vəhşi tipdən daha böyük idi (Əlavə Şəkil 13a, b, d). CLV3 və STM RNT-nin yerində hibridləşməsi della mutantlarda meristem genişlənməsini təsdiqlədi və daha sonra kök hüceyrə yuvasının yanal genişlənməsini göstərdi (Əlavə Şəkil 13e, f, h, i). Bununla belə, SAM əyriliyi hər iki genotipdə oxşar idi (Əlavə Şəkil 13k, m, n, p). Vəhşi tiplə müqayisədə əyrilik dəyişmədən gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dördlü mutantda oxşar ölçü artımını müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 13c, d, g, j, l, o, p). Hüceyrə bölünməsi istiqamətinin tezliyi della dördlü mutantda da təsirləndi, lakin della monolit mutantdan daha az dərəcədə (Əlavə Şəkil 12d-f). Bu doza effekti əyriliyə təsirin olmaması ilə yanaşı, Della dördlü mutantında qalıq RGL3 aktivliyinin DELLA fəaliyyətinin itirilməsi nəticəsində yaranan hüceyrə bölünməsi oriyentasiyasındakı dəyişiklikləri məhdudlaşdırdığını və yan hüceyrə bölmələrində dəyişikliklərin SAM həndəsəsindəki dəyişikliklərdən daha çox GA siqnal aktivliyindəki dəyişikliklərə cavab olaraq baş verdiyini göstərir. Yuxarıda təsvir olunduğu kimi, CUC2 promotoru P4-dən başlayaraq SAM-da IPR ifadəsini idarə edir (Əlavə Şəkil 14a, b) və bunun əksinə olaraq, pCUC2::gai-1-VENUS SAM ölçüsü azaldılmış, lakin daha yüksək əyriliyə malikdir (Əlavə Şəkil 14c-h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasındakı bu dəyişiklik vəhşi tiplə müqayisədə mexaniki gərginliklərin fərqli paylanması ilə nəticələnə bilər, burada yüksək çevrəvi gərginliklər SAM mərkəzindən daha qısa məsafədə başlayır47. Alternativ olaraq, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasındakı dəyişikliklər transgen ifadəsi ilə induksiya edilən regional mexaniki xassələrdəki dəyişikliklər nəticəsində baş verə bilər48. Hər iki halda, bu, müşahidələrimizi izah edərək, hüceyrələrin çevrəvi/eninə oriyentasiyada bölünmə ehtimalını artırmaqla GA siqnalındakı dəyişikliklərin təsirini qismən kompensasiya edə bilər.
Birlikdə götürdükdə, məlumatlarımız təsdiqləyir ki, daha yüksək GA siqnalı İPR-də hüceyrə bölünməsi müstəvisinin yanal oriyentasiyasında aktiv rol oynayır. Onlar həmçinin göstərirlər ki, meristem əyriliyi də İPR-də hüceyrə bölünmə müstəvisinin oriyentasiyasına təsir göstərir.
Yüksək GA siqnal aktivliyinə görə İPR-də bölünmə müstəvisinin eninə istiqaməti, GA-nın sonradan epidermal internodda tapılacaq hüceyrə quruluşunu müəyyən etmək üçün SAM daxilində epidermisdə radial hüceyrə faylını əvvəlcədən təşkil etdiyini göstərir. Həqiqətən, belə hüceyrə faylları della qlobal mutantlarının SAM şəkillərində tez-tez görünürdü (Şəkil 6b). Beləliklə, SAM-da GA siqnalının məkan modelinin inkişaf funksiyasını daha da araşdırmaq üçün biz vəhşi tipdə (Ler və Col-0), della qlobal mutantlarda və pCUC2 :: gai-1-VENUS transgen bitkilərində İPR-də hüceyrələrin məkan təşkilini təhlil etmək üçün time-lapse təsvirindən istifadə etdik.
Biz tapdıq ki, qmRGA IPR-də GA siqnal aktivliyinin P1/P2-dən artdığını və P4-də zirvəyə çatdığını və bu nümunənin zamanla sabit qaldığını göstərdi (Şəkil 4a-f və Əlavə Şəkil 8c-f, k). Artan GA siqnalı ilə İPR-də hüceyrələrin məkan təşkilini təhlil etmək üçün biz ilk müşahidədən 34 saat sonra təhlil edilən inkişaf taleyinə görə, yəni P1/P2-dən P4-ə qədər primordium inkişafı zamanı İPR hüceyrələrini izləməyə imkan verən, P4-ün yuxarı və tərəflərinə Ler IPR hüceyrələrini etiketlədik. Biz üç fərqli rəngdən istifadə etdik: P4 yaxınlığında primordiuma inteqrasiya olunmuş hüceyrələr üçün sarı, İPR-də olanlar üçün yaşıl və hər iki prosesdə iştirak edənlər üçün bənövşəyi (Şəkil 7a-c). t0-da (0 saat), P4-ün qarşısında 1-2 təbəqə IPR hüceyrələri göründü (Şəkil 7a). Gözlənildiyi kimi, bu hüceyrələr bölündükdə bunu əsasən eninə bölmə müstəvisi vasitəsilə həyata keçirdilər (şək. 7a-c). Oxşar nəticələr Col-0 SAM-dan istifadə etməklə əldə edilmişdir (sərhədləri Lerdə P4-ə oxşar olan P3-ə diqqət yetirməklə), baxmayaraq ki, bu genotipdə çiçək sərhədində əmələ gələn qıvrım İPR hüceyrələrini daha tez gizlədir (Şəkil 7g-i). Beləliklə, İPR hüceyrələrinin bölünmə nümunəsi hüceyrələri internodlarda olduğu kimi radial sıralara əvvəlcədən təşkil edir. Radial cərgələrin təşkili və ardıcıl orqanlar arasında İPR hüceyrələrinin lokalizasiyası bu hüceyrələrin internodal atalar olduğunu göstərir.
Burada, biz endogen siqnal yollarına müdaxiləni minimuma endirməklə, birləşmiş GA və GA reseptor konsentrasiyaları nəticəsində yaranan GA siqnal fəaliyyətinin kəmiyyət xəritələşdirilməsinə imkan verən və bununla da hüceyrə səviyyəsində GA funksiyası haqqında məlumat verən ratsional GA siqnal biosensorunu, qmRGA hazırladıq. Bu məqsədlə biz DELLA-nın qarşılıqlı əlaqə partnyorlarını bağlamaq qabiliyyətini itirmiş, lakin GA-induksiya etdiyi proteolizə həssas olan dəyişdirilmiş DELLA zülalı, mRGA yaratdıq. qmRGA GA səviyyələrində həm ekzogen, həm də endogen dəyişikliklərə cavab verir və onun dinamik hissetmə xassələri inkişaf zamanı GA siqnal fəaliyyətində məkan-zaman dəyişikliklərinin qiymətləndirilməsinə imkan verir. qmRGA həm də çox çevik bir vasitədir, çünki o, ifadəsi üçün istifadə olunan promotoru dəyişdirərək (zəruri olduqda) müxtəlif toxumalara uyğunlaşdırıla bilər və angiospermlər arasında GA siqnal yolunun və PFYRE motivinin qorunmuş təbiətini nəzərə alaraq, çox güman ki, digər növlərə ötürülə bilər22. Buna uyğun olaraq, düyü SLR1 DELLA zülalında (HYY497AAA) ekvivalent mutasiya da göstərildi ki, SLR1-in böyümə repressor fəaliyyətini boğur, eyni zamanda mRGA23-ə bənzər onun GA vasitəçiliyi ilə deqradasiyasını bir qədər azaldır. Qeyd edək ki, Arabidopsisdə aparılan son tədqiqatlar göstərdi ki, PFYRE domenində (S474L) bir amin turşusu mutasiyası RGA-nın transkripsiya faktoru partnyorları ilə qarşılıqlı əlaqə qabiliyyətinə təsir etmədən transkripsiya fəaliyyətini dəyişib50. Bu mutasiya mRGA-da mövcud olan 3 amin turşusu əvəzetməsinə çox yaxın olsa da, araşdırmalarımız göstərir ki, bu iki mutasiya DELLA-nın fərqli xüsusiyyətlərini dəyişdirir. Transkripsiya faktoru tərəfdaşlarının əksəriyyəti DELLA26,51-in LHR1 və SAW domenlərinə bağlansa da, PFYRE domenindəki bəzi konservləşdirilmiş amin turşuları bu qarşılıqlı təsirləri sabitləşdirməyə kömək edə bilər.
İnternode inkişafı bitki arxitekturasında və məhsuldarlığın yaxşılaşdırılmasında əsas xüsusiyyətdir. qmRGA, IPR internode progenitor hüceyrələrində daha yüksək GA siqnal aktivliyini aşkar etdi. Kəmiyyət görüntüləmə və genetikanı birləşdirərək, biz göstərdik ki, GA siqnal nümunələri SAM epidermisində dairəvi/eninə hüceyrə bölünməsi müstəvilərini üst-üstə qoyur, internode inkişafı üçün lazım olan hüceyrə bölünməsi təşkilatını formalaşdırır. İnkişaf zamanı hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasının bir neçə tənzimləyicisi müəyyən edilmişdir52,53. Bizim işimiz GA siqnal fəaliyyətinin bu hüceyrə parametrini necə tənzimlədiyinin bariz nümunəsini təqdim edir. DELLA əvvəlcədən qatlanan protein kompleksləri ilə qarşılıqlı əlaqədə ola bilər41, buna görə də GA siqnalı kortikal mikrotubul oriyentasiyasına birbaşa təsir edərək hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasını tənzimləyə bilər40,41,54,55. Biz gözlənilmədən göstərdik ki, SAM-da daha yüksək GA siqnal fəaliyyətinin korrelyasiyası hüceyrə uzanması və ya bölünməsi deyil, yalnız böyümə anizotropiyası idi ki, bu da GA-nın İPR-də hüceyrə bölünməsi istiqamətində birbaşa təsiri ilə uyğun gəlir. Bununla belə, biz bu təsirin dolayı yolla da ola biləcəyini istisna edə bilmərik, məsələn, GA-nin səbəb olduğu hüceyrə divarının yumşaldılması56. Hüceyrə divarının xassələrindəki dəyişikliklər mexaniki gərginliyə səbəb olur57,58, bu da kortikal mikrotubulların oriyentasiyasına təsir edərək hüceyrə bölünməsi müstəvisinin oriyentasiyasına təsir göstərə bilər39,46,59. GA-dan qaynaqlanan mexaniki gərginliyin və mikrotubul oriyentasiyasının GA tərəfindən birbaşa tənzimlənməsinin birləşmiş təsirləri, internodları müəyyən etmək üçün İPR-də hüceyrə bölünməsi oriyentasiyasının spesifik nümunəsinin yaradılmasında iştirak edə bilər və bu fikri yoxlamaq üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var. Eynilə, əvvəlki tədqiqatlar DELLA ilə qarşılıqlı təsir göstərən TCP14 və 15 zülallarının internod əmələ gəlməsinə nəzarətdə əhəmiyyətini vurğulamışdır60,61 və bu amillər internodların inkişafını tənzimləyən BREVIPEDICELLUS (BP) və PENNYWISE (PNY) ilə birlikdə GA-nın fəaliyyətinə vasitəçilik edə bilər və GA2 siqnalına təsir göstərdiyi göstərilmişdir. DELLA-ların brassinosteroid, etilen, jasmonic turşusu və absisik turşu (ABA) siqnal yolları63,64 ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu və bu hormonların mikrotubul oriyentasiyasına65 təsir göstərə biləcəyini nəzərə alsaq, GA-nın hüceyrə bölünməsi oriyentasiyasına təsiri digər hormonlar tərəfindən də vasitəçi ola bilər.
Erkən sitoloji tədqiqatlar göstərdi ki, internode inkişafı üçün Arabidopsis SAM-ın həm daxili, həm də xarici bölgələri tələb olunur2,42. GA-nın daxili toxumalarda hüceyrə bölünməsini aktiv şəkildə tənzimləməsi12 SAM-da meristem və internod ölçüsünü tənzimləməkdə GA-nın ikili funksiyasını dəstəkləyir. İstiqamətli hüceyrə bölünməsinin nümunəsi daxili SAM toxumasında da sıx şəkildə tənzimlənir və bu tənzimləmə kök böyüməsi üçün vacibdir52. GA-nın daxili SAM təşkilatında hüceyrə bölünməsi müstəvisinin istiqamətləndirilməsində də rol oynayıb-oynamadığını araşdırmaq maraqlı olacaq və bununla da SAM daxilində internodların spesifikasiyası və inkişafını sinxronlaşdıracaq.
Fidanların daimi işıq və 2 °C şaquli plitələrdə yetişdirildiyi hipokotil və kök böyüməsi təcrübələri istisna olmaqla, standart şəraitdə (16 saat işıq, 22 °C) bitkilər torpaqda və ya 1% saxaroza və 1% agar (Siqma) ilə əlavə edilmiş 1x Murashige-Skoog (MS) mühitində (Duchefa) in vitro əkilmişdir. Nitrat təcrübələri üçün bitkilər adekvat nitrat (0 və ya 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-süksinat, 1% saxaroza və 1% A-aqar (Siqma) ilə əlavə edilmiş dəyişdirilmiş MS mühitində (bioWORLD bitki mühiti) uzun gün şəraitində yetişdirildi.
pDONR221-ə daxil edilmiş GID1a cDNA pUBQ10::GID1a-mCherry yaratmaq üçün pDONR P4-P1R-pUBQ10 və pDONR P2R-P3-mCherry ilə pB7m34GW-də yenidən birləşdirildi. pDONR221-ə daxil edilmiş IDD2 DNT p35S:IDD2-RFP yaratmaq üçün pB7RWG266-da yenidən birləşdirildi. pGID1b::2xmTQ2-GID1b yaratmaq üçün, GID1b kodlaşdırma bölgəsinin yuxarı axınında 3,9 kb fraqment və GID1b cDNA (1,3 kb) və terminatoru (3,4 kb) ehtiva edən 4,7 kb fraqment əvvəlcə P3-R-ə əlavə edilmiş primerlərdən istifadə edərək gücləndirilmiş və sonra P1R4P-yə daxil edilmişdir. (Thermo Fisher Scientific) və pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) müvafiq olaraq və nəhayət, Gateway klonlamasından istifadə edərək pGreen 012567 hədəf vektoruna pDONR221 2xmTQ268 ilə rekombinasiya edilmişdir. pCUC2::LSSmOrange yaratmaq üçün CUC2 promotor ardıcıllığı (ATG-dən yuxarı 3229 bp), ardından N7 nüvə lokalizasiyası siqnalı ilə böyük Stokes-dəyişdirilmiş mOrange (LSSmOrange)69 kodlaşdırma ardıcıllığı və NOS transkripsiya terminatoru pGreenframe kancinamy vektorundan istifadə edərək pGreen frangamy vektoruna yığılmışdır. rekombinasiya sistemi (Invitrogen). Bitki ikili vektoru Agrobacterium tumefaciens ştammı GV3101 və Nicotiana benthamiana yarpaqlarına Agrobacterium infiltrasiya üsulu ilə, Arabidopsis thaliana Col-0 isə çiçək daldırma üsulu ilə daxil edilmişdir. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry və pCLV3::mCherry-NLS qmRGA müvafiq olaraq, müvafiq xaçların F3 və F1 nəslindən təcrid edilmişdir.
RNT in situ hibridizasiyası təxminən 1 sm uzunluğunda tumurcuqların uclarında72 aparıldı, onlar toplandı və dərhal 4 °C-ə qədər əvvəlcədən soyudulmuş FAA məhlulunda (3,7% formaldehid, 5% sirkə turşusu, 50% etanol) fiksasiya olundu. 2 × 15 dəqiqəlik vakuum müalicəsindən sonra fiksator dəyişdirildi və nümunələr bir gecədə inkubasiya edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 və RGL3 cDNA-ları və onların 3′-UTR-lərinə antisens zondları Rosier və digərləri73 tərəfindən təsvir olunduğu kimi Əlavə Cədvəl 3-də göstərilən primerlərdən istifadə etməklə sintez edilmişdir. Digoksigenin etiketli zondlar digoksigenin antikorları (3000 qat seyreltmə; Roche, kataloq nömrəsi: 11 093 274 910) istifadə edərək immuno-təsbit edildi və kəsiklər 5-bromo-4-xloro-3-indolil fosfat (BCIP-270-qatlanma) ilə boyandı. (NBT, 200 qat qatılma) məhlulu.
Göndərmə vaxtı: 10 fevral 2025-ci il