Çubuğun apikal meristemasının (SAM) böyüməsi gövdə quruluşu üçün vacibdir. Bitki hormonlarıgibberellinlər(GA) bitki böyüməsinin əlaqələndirilməsində əsas rol oynayır, lakin onların SAM-dakı rolu hələ də zəif başa düşülür. Burada, GA transkripsiya reaksiyasında əsas tənzimləyici funksiyasını basdırmaq və GA tanıma zamanı onun parçalanmasını qorumaq üçün DELLA zülalını mühəndisliklə GA siqnalının nisbətometrik biosensorunu hazırladıq. Bu parçalanmaya əsaslanan biosensorun inkişaf zamanı GA səviyyələrində və hüceyrə sensorundakı dəyişiklikləri dəqiq qeyd etdiyini nümayiş etdiririk. Bu biosensordan SAM-da GA siqnal fəaliyyətini xəritələşdirmək üçün istifadə etdik. Yüksək GA siqnallarının əsasən düyünlərarası hüceyrələrin sələfləri olan orqan primordiyaları arasında yerləşən hüceyrələrdə mövcud olduğunu göstəririk. Qazanc və funksiya itkisi yanaşmalarından istifadə edərək, GA-nın hüceyrə bölünmə müstəvisinin istiqamətini tənzimlədiyini, düyünlərarası hüceyrə təşkilatını qurduğunu və bununla da SAM-da düyünlərarası spesifikasiyanı təşviq etdiyini daha da nümayiş etdiririk.
Çubuq zirvəsində yerləşən tumurcuq apikal meristemi (SAM), bitkinin həyatı boyunca modul və təkrarlanan şəkildə yan orqanlar və kök düyünləri yaradan kök hüceyrələrinin bir yuvasını ehtiva edir. Bu təkrarlanan vahidlərin və ya bitki düyünlərinin hər biri düyünlərdəki internodal və yan orqanlar, eləcə də yarpaq qoltuqlarındakı qoltuq meristemlərini əhatə edir1. Bitki düyünlərinin böyüməsi və təşkili inkişaf zamanı dəyişir. Arabidopsisdə vegetativ mərhələdə internodal böyümə bastırılır və qoltuq meristemləri rozet yarpaqlarının qoltuqlarında hərəkətsiz qalır. Çiçək fazasına keçid zamanı SAM çiçəklənmə meristemasına çevrilir və uzanan internodal və qoltuq qönçələri, gül yarpaqlarının qoltuqlarında budaqlar və daha sonra yarpaqsız çiçəklər əmələ gətirir2. Yarpaqların, çiçəklərin və budaqların əmələ gəlməsini idarə edən mexanizmləri anlamaqda əhəmiyyətli irəliləyiş əldə etsək də, internodalların necə yarandığı haqqında nisbətən az məlumat var.
GA-ların məkan-zaman paylanmasını anlamaq, bu hormonların müxtəlif toxumalarda və müxtəlif inkişaf mərhələlərindəki funksiyalarını daha yaxşı başa düşməyə kömək edəcəkdir. Öz promotorunun təsiri altında ifadə olunan RGA-GFP birləşməsinin deqradasiyasının vizuallaşdırılması köklərdə ümumi GA səviyyələrinin tənzimlənməsi haqqında vacib məlumat verir15,16. Lakin, RGA ifadəsi toxumalar arasında dəyişir17 və GA18 tərəfindən tənzimlənir. Beləliklə, RGA promotorunun diferensial ifadəsi RGA-GFP ilə müşahidə olunan flüoresans nümunəsinə səbəb ola bilər və buna görə də bu metod kəmiyyət xarakteri daşımır. Daha yaxınlarda bioaktiv flüoresen (Fl) ilə işarələnmiş GA19,20 kök endokorteksində GA-nın toplanmasını və onun hüceyrə səviyyələrinin GA daşınması ilə tənzimlənməsini aşkar etdi. Bu yaxınlarda GA FRET sensoru nlsGPS1 göstərdi ki, GA səviyyələri köklərdə, filamentlərdə və tünd rəngli hipokotillərdə21 hüceyrə uzanması ilə əlaqəlidir. Lakin, gördüyümüz kimi, GA konsentrasiyası GA siqnal fəaliyyətini idarə edən yeganə parametr deyil, çünki o, mürəkkəb sensor proseslərindən asılıdır. Burada, DELLA və GA siqnal yolları haqqında anlayışımıza əsaslanaraq, GA siqnalı üçün deqradasiyaya əsaslanan nisbətometrik biosensorun hazırlanmasını və xarakteristikasını təqdim edirik. Bu kəmiyyət biosensorunu inkişaf etdirmək üçün flüoresan zülala birləşdirilmiş və toxumalarda hər yerdə ifadə edilən mutant GA-həssas RGA-dan, eləcə də GA-həssas olmayan flüoresan zülaldan istifadə etdik. Mutant RGA zülal birləşmələrinin hər yerdə ifadə edildikdə endogen GA siqnalına müdaxilə etmədiyini və bu biosensorun həm GA girişi, həm də sensor aparatı tərəfindən yüksək məkan-zamana qətnamə ilə GA siqnalının emalı nəticəsində yaranan siqnal fəaliyyətini ölçə biləcəyini göstəririk. Bu biosensordan GA siqnal fəaliyyətinin məkan-zamana paylanmasını xəritələşdirmək və GA-nın SAM epidermisində hüceyrə davranışını necə tənzimlədiyini ölçmək üçün istifadə etdik. Biz GA-nın orqan primordiyaları arasında yerləşən SAM hüceyrələrinin bölünmə müstəvisinin istiqamətini tənzimlədiyini və bununla da internodun kanonik hüceyrə quruluşunu təyin etdiyini nümayiş etdiririk.
Nəhayət, qmRGA-nın böyüyən hipokotillərdən istifadə edərək endogen GA səviyyələrindəki dəyişiklikləri bildirə biləcəyini soruşduq. Əvvəllər nitratın GA sintezini və öz növbəsində DELLA34 deqradasiyasını artıraraq böyüməni stimullaşdırdığını göstərmişdik. Müvafiq olaraq, bol nitrat tədarükü (10 mM NO3−) altında yetişdirilən pUBQ10::qmRGA fidanlarında hipokotil uzunluğunun nitrat çatışmazlığı şəraitində yetişdirilən fidanlara nisbətən xeyli uzun olduğunu müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 6a). Böyümə reaksiyasına uyğun olaraq, GA siqnalları 10 mM NO3− şəraitində yetişdirilən fidanların hipokotillərində nitrat olmadığı halda yetişdirilən fidanlara nisbətən daha yüksək idi (Əlavə Şəkil 6b, c). Beləliklə, qmRGA həmçinin GA konsentrasiyasında endogen dəyişikliklərin yaratdığı GA siqnalındakı dəyişikliklərin monitorinqini də təmin edir.
Sensor dizaynına əsasən gözlənildiyi kimi, qmRGA tərəfindən aşkar edilən GA siqnal aktivliyinin GA konsentrasiyasından və GA qavrayışından asılı olub-olmadığını anlamaq üçün vegetativ və reproduktiv toxumalarda üç GID1 reseptorunun ifadəsini təhlil etdik. Fidanlarda GID1-GUS reportyor xətti GID1a və c-nin kotiledonlarda yüksək dərəcədə ifadə olunduğunu göstərdi (Şəkil 3a–c). Bundan əlavə, hər üç reseptor yarpaqlarda, yan kök primordiyalarında, kök uclarında (GID1b-nin kök qapağı istisna olmaqla) və damar sistemində ifadə edildi (Şəkil 3a–c). Çiçəklənmə SAM-da yalnız GID1b və 1c üçün GUS siqnallarını aşkar etdik (Əlavə Şəkil 7a–c). Yerində hibridləşmə bu ifadə nümunələrini təsdiqlədi və daha sonra GID1c-nin SAM-da aşağı səviyyələrdə bərabər şəkildə ifadə olunduğunu, GID1b-nin isə SAM-ın periferiyasında daha yüksək ifadə göstərdiyini göstərdi (Əlavə Şəkil 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translyasiya birləşməsi həmçinin SAM-ın mərkəzində aşağı və ya heç bir ifadədən orqan sərhədlərində yüksək ifadəyə qədər GID1b ifadəsinin dərəcəli diapazonunu aşkar etdi (Əlavə Şəkil 7m). Beləliklə, GID1 reseptorları toxumalar arasında və daxilində bərabər paylanmır. Sonrakı təcrübələrdə biz həmçinin müşahidə etdik ki, GID1-in (pUBQ10::GID1a-mCherry) həddindən artıq ifadəsi hipokotillərdə qmRGA-nın xarici GA tətbiqinə həssaslığını artırdı (Şəkil 3d, e). Əksinə, hipokotildə qd17mRGA ilə ölçülən flüoresans GA3 müalicəsinə həssas deyildi (Şəkil 3f, g). Hər iki analiz üçün sensorun sürətli davranışını qiymətləndirmək üçün fidanlar yüksək konsentrasiyalı GA (100 μM GA3) ilə müalicə edildi, burada GID1 reseptoruna bağlanma qabiliyyəti artdı və ya itirildi. Bu nəticələr birlikdə qmRGA biosensorunun GA və GA sensoru kimi birləşmiş funksiyanı yerinə yetirdiyini təsdiqləyir və GID1 reseptorunun diferensial ifadəsinin sensorun emissiya qabiliyyətini əhəmiyyətli dərəcədə modulyasiya edə biləcəyini göstərir.
Bu günə qədər SAM-da GA siqnallarının paylanması qeyri-müəyyən olaraq qalır. Buna görə də, L1 SAM böyüməsinin idarə olunmasında əsas rol oynadığı üçün L1 təbəqəsinə (epidermis; Şəkil 4a, b, Metodlar və Əlavə Metodlara baxın) diqqət yetirərək GA siqnal fəaliyyətinin yüksək qətnaməli kəmiyyət xəritələrini hesablamaq üçün qmRGA ifadə edən bitkilərdən və pCLV3::mCherry-NLS kök hüceyrə reportyorundan35 istifadə etdik36. Burada pCLV3::mCherry-NLS ifadəsi GA siqnal fəaliyyətinin məkan-zaman paylanmasını təhlil etmək üçün sabit həndəsi istinad nöqtəsi təmin etdi37. GA yan orqanların inkişafı üçün vacib hesab edilsə də4, P3 mərhələsindən başlayaraq çiçəkli primordiumda (P) GA siqnallarının aşağı olduğunu müşahidə etdik (Şəkil 4a, b), gənc P1 və P2 primordiumlarında isə mərkəzi bölgədəkinə bənzər orta aktivlik var idi (Şəkil 4a, b). Daha yüksək GA siqnal aktivliyi orqan primordium sərhədlərində, P1/P2-dən (sərhədin yanlarında) başlayaraq P4-də pik nöqtəsinə çataraq, eləcə də primordiyalar arasında yerləşən periferik bölgənin bütün hüceyrələrində aşkar edilmişdir (Şəkil 4a, b və Əlavə Şəkil 8a, b). Bu daha yüksək GA siqnal aktivliyi yalnız epidermisdə deyil, həm də L2 və yuxarı L3 təbəqələrində müşahidə edilmişdir (Əlavə Şəkil 8b). qmRGA istifadə edərək SAM-da aşkar edilən GA siqnallarının nümunəsi də zamanla dəyişməz qalmışdır (Əlavə Şəkil 8c–f, k). qd17mRGA konstruksiyası ətraflı şəkildə xarakterizə etdiyimiz beş müstəqil xəttdən T3 bitkilərinin SAM-ında sistematik şəkildə aşağı tənzimlənsə də, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstruksiyası ilə əldə edilən flüoresans nümunələrini təhlil edə bildik (Əlavə Şəkil 8g–j, l). Bu nəzarət xəttində SAM-da flüoresans nisbətində yalnız kiçik dəyişikliklər aşkar edildi, lakin SAM mərkəzində TagBFP ilə əlaqəli VENUS-da aydın və gözlənilməz bir azalma müşahidə etdik. Bu, qmRGA tərəfindən müşahidə edilən siqnalizasiya modelinin mRGA-VENUS-un GA-dan asılı deqradasiyasını əks etdirdiyini təsdiqləyir, eyni zamanda qmRGA-nın meristem mərkəzində GA siqnalizasiya aktivliyini həddindən artıq qiymətləndirə biləcəyini göstərir. Xülasə, nəticələrimiz əsasən primordiyaların paylanmasını əks etdirən GA siqnalizasiya modelinə işarə edir. İlkinlərarası bölgənin (İİR) bu paylanması, inkişaf edən primordium və mərkəzi bölgə arasında yüksək GA siqnalizasiya aktivliyinin tədricən qurulması ilə əlaqədardır, eyni zamanda primordiumda GA siqnalizasiya aktivliyi azalır (Şəkil 4c, d).
GID1b və GID1c reseptorlarının paylanması (yuxarıya baxın) göstərir ki, GA reseptorlarının diferensial ifadəsi SAM-da GA siqnal aktivliyinin modelinin formalaşmasına kömək edir. GA-nın diferensial yığılmasının iştirak edib-etmədiyini düşündük. Bu ehtimalı araşdırmaq üçün nlsGPS1 GA FRET sensorundan21 istifadə etdik. 100 dəqiqə ərzində 10 μM GA4+7 ilə müalicə olunan nlsGPS1-in SAM-ında artan aktivləşmə tezliyi aşkar edilmişdir (Əlavə Şəkil 9a–e), bu da nlsGPS1-in köklərdə21-də olduğu kimi SAM-da GA konsentrasiyanındakı dəyişikliklərə cavab verdiyini göstərir. nlsGPS1 aktivləşmə tezliyinin məkan paylanması SAM-ın xarici təbəqələrində nisbətən aşağı GA səviyyələrini aşkar etdi, lakin onların mərkəzdə və SAM-ın sərhədlərində yüksəldiyini göstərdi (Şəkil 4e və Əlavə Şəkil 9a,c). Bu, GA-nın SAM-da da qmRGA tərəfindən aşkar edilənə bənzər bir məkan modelinə malik paylandığını göstərir. Tamamlayıcı bir yanaşma olaraq, SAM-ı flüoresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) və ya mənfi nəzarət olaraq təkcə Fl ilə müalicə etdik. Fl siqnalı daha aşağı intensivlikdə olsa da, mərkəzi bölgə və primordium da daxil olmaqla SAM boyunca paylandı (Şəkil 4j və Əlavə Şəkil 10d). Bunun əksinə olaraq, hər üç GA-Fl, xüsusən də primordium sərhədləri daxilində və IPR-in qalan hissəsində müxtəlif dərəcələrdə toplandı, GA7-Fl isə IPR-in ən böyük domenində toplandı (Şəkil 4k və Əlavə Şəkil 10a,b). Flüoresans intensivliyinin kəmiyyətləndirilməsi göstərdi ki, GA-Fl ilə müalicə olunmuş SAM-da IPR-in IPR olmayan intensivliyə nisbəti Fl ilə müalicə olunmuş SAM-a nisbətən daha yüksək idi (Şəkil 4l və Əlavə Şəkil 10c). Birlikdə, bu nəticələr göstərir ki, GA orqan sərhədinə ən yaxın yerləşən IPR hüceyrələrində daha yüksək konsentrasiyalarda mövcuddur. Bu, SAM GA siqnal aktivliyinin modelinin həm GA reseptorlarının diferensial ifadəsindən, həm də orqan sərhədlərinə yaxın IPR hüceyrələrində GA-nın diferensial toplanmasından qaynaqlandığını göstərir. Beləliklə, təhlilimiz SAM-ın mərkəzində və primordiumunda daha aşağı aktivlik və periferik bölgədə IPR-də daha yüksək aktivlik ilə gözlənilməz məkan-zamana GA siqnal modelinin olduğunu aşkar etdi.
SAM-da diferensial GA siqnal aktivliyinin rolunu anlamaq üçün SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS-in real vaxt rejimində görüntüləməsindən istifadə edərək GA siqnal aktivliyi, hüceyrə genişlənməsi və hüceyrə bölünməsi arasındakı korrelyasiyanı təhlil etdik. GA-nın böyümə tənzimlənməsindəki rolunu nəzərə alaraq, hüceyrə genişlənməsi parametrləri ilə müsbət korrelyasiya gözlənilirdi. Buna görə də, əvvəlcə GA siqnal aktivliyi xəritələrini hüceyrə səthinin böyümə sürətinin xəritələri (verilmiş bir hüceyrə və bölünmə zamanı qız hüceyrələri üçün hüceyrə genişlənməsinin gücünün proksi kimi) və hüceyrə genişlənməsinin istiqamətini ölçən böyümə anizotropiyası xəritələri ilə müqayisə etdik (burada da müəyyən bir hüceyrə və bölünmə zamanı qız hüceyrələri üçün istifadə olunur; Şəkil 5a, b, Metodlar və Əlavə Metodlara baxın). SAM hüceyrə səthinin böyümə sürətinin xəritələrimiz əvvəlki müşahidələrlə38,39 uyğundur, sərhəddə minimal böyümə sürətləri və inkişaf edən çiçəklərdə maksimum böyümə sürətləri var (Şəkil 5a). Əsas komponent təhlili (PCA) göstərdi ki, GA siqnal aktivliyi hüceyrə səthinin böyümə intensivliyi ilə mənfi korrelyasiya olunub (Şəkil 5c). Həmçinin göstərdik ki, GA siqnal girişi və böyümə intensivliyi daxil olmaqla, əsas variasiya oxları yüksək CLV3 ifadəsi ilə müəyyən edilmiş istiqamətə ortoqonaldır və bu da qalan təhlillərdə hüceyrələrin SAM mərkəzindən kənarlaşdırıldığını təsdiqləyir. Spearman korrelyasiya təhlili PCA nəticələrini təsdiqlədi (Şəkil 5d), bu da IPR-də daha yüksək GA siqnallarının daha yüksək hüceyrə genişlənməsinə səbəb olmadığını göstərir. Lakin, korrelyasiya təhlili GA siqnal aktivliyi ilə böyümə anizotropiyası arasında kiçik bir müsbət korrelyasiya aşkar etdi (Şəkil 5c, d), bu da IPR-də daha yüksək GA siqnalının hüceyrə böyüməsinin istiqamətinə və ehtimal ki, hüceyrə bölünmə müstəvisinin mövqeyinə təsir etdiyini göstərir.
a, b SAM-da orta səth böyüməsinin (a) və böyümə anizotropiyasının (b) istilik xəritələri yeddi müstəqil bitki üzərində orta hesablanmışdır (hüceyrə genişlənməsinin gücü və istiqaməti üçün müvafiq olaraq proksi kimi istifadə olunur). c PCA analizi aşağıdakı dəyişənləri əhatə edirdi: GA siqnalı, səth böyümə intensivliyi, səth böyümə anizotropiyası və CLV3 ifadəsi. PCA komponenti 1 əsasən səth böyümə intensivliyi ilə mənfi korrelyasiya olunmuş və GA siqnalı ilə müsbət korrelyasiya olunmuşdur. PCA komponenti 2 əsasən səth böyümə anizotropiyası ilə müsbət korrelyasiya olunmuş və CLV3 ifadəsi ilə mənfi korrelyasiya olunmuşdur. Faizlər hər bir komponent tərəfindən izah edilən dəyişkənliyi təmsil edir. d CZ istisna olmaqla toxuma miqyasında GA siqnalı, səth böyümə intensivliyi və səth böyümə anizotropiyası arasında Spearman korrelyasiya təhlili. Sağdakı rəqəm iki dəyişən arasındakı Spearman rho dəyəridir. Ulduz işarələri korrelyasiya/mənfi korrelyasiyanın yüksək əhəmiyyətli olduğu halları göstərir. e Konfokal mikroskopiya ilə Col-0 SAM L1 hüceyrələrinin 3D vizuallaşdırılması. 10 saatda SAM-da (lakin primordiumda deyil) əmələ gələn yeni hüceyrə divarları bucaq dəyərlərinə görə rənglənir. Rəng zolağı aşağı sağ küncdə göstərilir. Əlavədə 0 saatda müvafiq 3D görüntü göstərilir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. f Qutu qrafikləri IPR və IPR olmayan Col-0 SAM-da (n = 10 müstəqil bitki) hüceyrə bölünmə sürətlərini göstərir. Mərkəzi xətt medianı, qutu sərhədləri isə 25-ci və 75-ci persentilləri göstərir. Bığlar R proqram təminatı ilə müəyyən edilmiş minimum və maksimum dəyərləri göstərir. P dəyərləri Welch-in iki quyruqlu t-testi ilə əldə edilmişdir. g, h SAM-ın mərkəzindən (ağ nöqtəli xətt) radial istiqamətə nisbətən yeni hüceyrə divarının (bənövşəyi) bucağının necə ölçüləcəyini (yalnız kəskin bucaq dəyərləri, yəni 0–90° nəzərə alınır) və (h) meristema daxilində çevrə/yan və radial istiqamətləri göstərən sxematik diaqram. i SAM (tünd mavi), IPR (orta mavi) və IPR olmayan (açıq mavi) üzrə hüceyrə bölünmə müstəvisi istiqamətinin tezlik histoqramları. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov sınağı ilə əldə edilmişdir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlanmışdır. j IPR-in müvafiq olaraq P3 (açıq yaşıl), P4 (orta yaşıl) və P5 (tünd yaşıl) ətrafında hüceyrə bölünmə müstəvisi istiqamətinin tezlik histoqramları. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov sınağı ilə əldə edilmişdir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlanmışdır.
Buna görə də, analiz zamanı yeni əmələ gələn hüceyrə divarlarını müəyyən etməklə GA siqnalizasiyası ilə hüceyrə bölünməsi aktivliyi arasındakı korrelyasiyanı araşdırdıq (Şəkil 5e). Bu yanaşma bizə hüceyrə bölünməsinin tezliyini və istiqamətini ölçməyə imkan verdi. Təəccüblüdür ki, IPR-də və SAM-ın qalan hissəsində (qeyri-IPR, Şəkil 5f) hüceyrə bölünmə tezliyinin oxşar olduğunu aşkar etdik ki, bu da IPR və qeyri-IPR hüceyrələri arasında GA siqnalizasiyasındakı fərqlərin hüceyrə bölünməsinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir göstərmədiyini göstərir. Bu və GA siqnalizasiyası ilə böyümə anizotropiyası arasındakı müsbət korrelyasiya bizi GA siqnalizasiya aktivliyinin hüceyrə bölünməsi müstəvisinin istiqamətinə təsir edib-etmədiyini düşünməyə sövq etdi. Yeni hüceyrə divarının istiqamətini meristem mərkəzini və yeni hüceyrə divarının mərkəzini birləşdirən radial oxa nisbətən iti bucaq kimi ölçdük (Şəkil 5e-i) və hüceyrələrin radial oxa nisbətən 90°-yə yaxın bucaq altında bölünməsinə açıq bir meyl müşahidə etdik, ən yüksək tezliklər 70–80° (23.28%) və 80–90° (22.62%) (Şəkil 5e,i) səviyyəsində müşahidə edildi ki, bu da dairəvi/eninə istiqamətdə hüceyrə bölünmələrinə uyğundur (Şəkil 5h). GA siqnalının bu hüceyrə bölünmə davranışına verdiyi töhfəni araşdırmaq üçün IPR-də və IPR olmayan hüceyrə bölünmə parametrlərini ayrıca təhlil etdik (Şəkil 5i). IPR hüceyrələrində bölünmə bucağının paylanmasının IPR olmayan hüceyrələrdə və ya bütün SAM hüceyrələrində olduğundan fərqli olduğunu müşahidə etdik, IPR hüceyrələri daha yüksək lateral/dairəvi hüceyrə bölünmə nisbəti, yəni 70-80° və 80-90° (müvafiq olaraq 33,86% və 30,71%) nümayiş etdirir (Şəkil 5i). Beləliklə, müşahidələrimiz yüksək GA siqnalizasiyası ilə çevrə istiqamətinə yaxın hüceyrə bölünmə müstəvisi oriyentasiyası arasında GA siqnalizasiya aktivliyi ilə böyümə anizotropiyası arasındakı korrelyasiyaya bənzər bir əlaqəni ortaya qoydu (Şəkil 5c, d). Bu əlaqənin məkan qorunmasını daha da müəyyən etmək üçün, P3-dən başlayaraq primordiumu əhatə edən IPR hüceyrələrində bölünmə müstəvisi oriyentasiyasını ölçdük, çünki ən yüksək GA siqnalizasiya aktivliyi bu bölgədə P4-dən başlayaraq aşkar edilmişdir (Şəkil 4). IPR-in P3 və P4 ətrafındakı bölünmə bucaqları statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqlər göstərmədi, baxmayaraq ki, P4 ətrafındakı IPR-də lateral hüceyrə bölünmələrinin artan tezliyi müşahidə edildi (Şəkil 5j). Lakin, P5 ətrafındakı IPR hüceyrələrində hüceyrə bölünmə müstəvisinin istiqamətindəki fərq statistik cəhətdən əhəmiyyətli hala gəldi və eninə hüceyrə bölünmələrinin tezliyində kəskin artım müşahidə edildi (Şəkil 5j). Birlikdə, bu nəticələr göstərir ki, GA siqnalı SAM-da hüceyrə bölünmələrinin istiqamətini idarə edə bilər ki, bu da yüksək GA siqnalının IPR-də hüceyrə bölünmələrinin yan istiqamətini yarada biləcəyinə dair əvvəlki hesabatlarla uyğun gəlir40,41.
IPR-dəki hüceyrələrin primordiyaya deyil, düyünlərarası hüceyrələrə daxil ediləcəyi proqnozlaşdırılır2,42,43. IPR-də hüceyrə bölünmələrinin eninə istiqamətlənməsi, düyünlərarası hüceyrələrdə epidermal hüceyrələrin paralel uzununa sıralarının tipik təşkilinə səbəb ola bilər. Yuxarıda təsvir etdiyimiz müşahidələr göstərir ki, GA siqnalı hüceyrə bölünməsinin istiqamətini tənzimləməklə bu prosesdə rol oynayır.
Bir neçə DELLA geninin funksiyasının itirilməsi konstitutiv GA reaksiyasına səbəb olur və della mutantları bu hipotezi yoxlamaq üçün istifadə edilə bilər44. Əvvəlcə SAM-da beş DELLA geninin ifadə nümunələrini təhlil etdik. GUS xəttinin45 transkripsiya birləşməsi GAI, RGA, RGL1 və RGL2-nin (daha az dərəcədə) SAM-da ifadə olunduğunu göstərdi (Əlavə Şəkil 11a–d). In situ hibridləşmə daha sonra GAI mRNA-nın xüsusilə primordiya və inkişaf edən çiçəklərdə toplandığını göstərdi (Əlavə Şəkil 11e). RGL1 və RGL3 mRNA-sı SAM örtüyü boyunca və daha yaşlı çiçəklərdə aşkar edildi, halbuki RGL2 mRNA sərhəd bölgəsində daha çox idi (Əlavə Şəkil 11f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM-ın konfokal görüntüləməsi in situ hibridləşmə ilə müşahidə edilən ifadəni təsdiqlədi və RGL3 zülalının SAM-ın mərkəzi hissəsində toplandığını göstərdi (Əlavə Şəkil 11i). pRGA::GFP-RGA xəttindən istifadə edərək, RGA zülalının SAM-da toplandığını, lakin onun bolluğunun P4-dən başlayaraq sərhəddə azaldığını da aşkar etdik (Əlavə Şəkil 11j). Xüsusilə, RGL3 və RGA-nın ifadə nümunələri, qmRGA tərəfindən aşkar edildiyi kimi, IPR-də daha yüksək GA siqnal aktivliyi ilə uyğun gəlir (Şəkil 4). Bundan əlavə, bu məlumatlar bütün DELLA-ların SAM-da ifadə olunduğunu və onların ifadəsinin birlikdə bütün SAM-ı əhatə etdiyini göstərir.
Daha sonra vəhşi tipli SAM (Ler, nəzarət) və gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beşlik (qlobal) mutantlarında hüceyrə bölünmə parametrlərini təhlil etdik (Şəkil 6a, b). Maraqlıdır ki, vəhşi tiplə müqayisədə della qlobal mutant SAM-da hüceyrə bölünmə bucağı tezliklərinin paylanmasında statistik cəhətdən əhəmiyyətli bir dəyişiklik müşahidə etdik (Şəkil 6c). della qlobal mutantındakı bu dəyişiklik 80-90° bucaqların (34.71% vs. 24.55%) və daha az dərəcədə 70-80° bucaqların (23.78% vs. 20.18%) tezliyinin artması ilə əlaqədar idi, yəni eninə hüceyrə bölünmələrinə uyğundur (Şəkil 6c). Eninə olmayan bölünmələrin tezliyi (0-60°) della qlobal mutantında da daha aşağı idi (Şəkil 6c). Della qlobal mutantının SAM-ında eninə hüceyrə bölünmələrinin tezliyi əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 6b). IPR-də eninə hüceyrə bölünmələrinin tezliyi vəhşi tiplə müqayisədə della qlobal mutantında da daha yüksək idi (Şəkil 6d). IPR bölgəsindən kənarda vəhşi tip hüceyrə bölünmə bucaqlarının daha vahid paylanmasına malik idi, della qlobal mutant isə IPR kimi tangensial bölünmələrə üstünlük verirdi (Şəkil 6e). Həmçinin, GA-nın toplandığı GA-inaktiv mutant fonu olan ga2 oksidaza (ga2ox) beşlik mutantlarının (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 və ga2ox6-2) SAM-ında hüceyrə bölünmələrinin istiqamətini ölçdük. GA səviyyələrinin artması ilə uyğun olaraq, beşlik ga2ox mutant inflorescence-nin SAM-ı Col-0-dan daha böyük idi (Əlavə Şəkil 12a, b) və Col-0 ilə müqayisədə beşlik ga2ox SAM hüceyrə bölünmə bucaqlarının fərqli bir paylanması göstərdi, bucaq tezliyi 50°-dən 90°-yə qədər artdı, yəni yenidən tangensial bölünmələrə üstünlük verdi (Əlavə Şəkil 12a–c). Beləliklə, GA siqnalının və GA yığılmasının konstitutiv aktivləşməsinin IPR-də və SAM-ın qalan hissəsində lateral hüceyrə bölünmələrinə səbəb olduğunu göstəririk.
a, b Konfokal mikroskopiya istifadə edərək PI ilə boyanmış Ler (a) və qlobal della mutant (b) SAM-ın L1 təbəqəsinin 3D vizuallaşdırılması. 10 saatlıq müddət ərzində SAM-da (lakin primordiumda deyil) əmələ gələn yeni hüceyrə divarları göstərilir və bucaq dəyərlərinə uyğun olaraq rənglənir. Əlavədə 0 saatda SAM göstərilir. Rəng zolağı aşağı sağ küncdə göstərilir. (b)-dəki ox qlobal della mutantında hizalanmış hüceyrə fayllarının nümunəsinə işarə edir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. Ler və qlobal della arasında bütün SAM (d), IPR (e) və qeyri-IPR (f)-də hüceyrə bölünmə müstəvisi istiqamətlərinin tezlik paylanmasının ce müqayisəsi. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov testi istifadə edilərək əldə edilmişdir. f, g Col-0 (i) və pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgen bitkilərin PI ilə boyanmış SAM-ının konfokal görüntülərinin 3D vizuallaşdırılması. Panellər (a, b) 10 saat ərzində SAM-da əmələ gələn yeni hüceyrə divarlarını (lakin primordiyaları deyil) göstərir. Təcrübə oxşar nəticələrlə iki dəfə təkrarlandı. h–j Col-0 və pCUC2::gai-1-VENUS bitkiləri arasında bütün SAM-da (h), IPR (i) və qeyri-IPR (j)-də yerləşən hüceyrə bölünmə müstəvisi istiqamətlərinin tezlik paylanmasının müqayisəsi. P dəyərləri iki quyruqlu Kolmogorov-Smirnov testi istifadə edilərək əldə edilmişdir.
Daha sonra GA siqnalının inhibə edilməsinin təsirini xüsusilə IPR-də sınaqdan keçirdik. Bu məqsədlə, VENUS-a birləşdirilmiş dominant mənfi gai-1 zülalının (pCUC2::gai-1-VENUS xəttində) ifadəsini stimullaşdırmaq üçün kotiledon kuboku 2 (CUC2) promotorundan istifadə etdik. Vəhşi tipli SAM-da, CUC2 promotoru P4-dən etibarən sərhəd hüceyrələri də daxil olmaqla, SAM-dakı əksər IPR-lərin ifadəsini stimullaşdırır və oxşar spesifik ifadə pCUC2::gai-1-VENUS bitkilərində müşahidə edilmişdir (aşağıya baxın). pCUC2::gai-1-VENUS bitkilərinin SAM və ya IPR-də hüceyrə bölünmə bucaqlarının paylanması vəhşi tipdəkindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmədi, baxmayaraq ki, gözlənilmədən bu bitkilərdə IPR olmayan hüceyrələrin daha yüksək tezlikdə 80-90° bölündüyünü aşkar etdik (Şəkil 6f-j).
Hüceyrə bölünməsinin istiqamətinin SAM-ın həndəsəsindən, xüsusən də toxuma əyriliyinin yaratdığı dartılma gərginliyindən asılı olduğu irəli sürülmüşdür46. Buna görə də, SAM-ın formasının della global mutantında və pCUC2::gai-1-VENUS bitkilərində dəyişdirilib-dəyişdirilmədiyini soruşduq. Əvvəllər bildirildiyi kimi12, della global mutant SAM-ın ölçüsü vəhşi tipdən daha böyük idi (Əlavə Şəkil 13a, b, d). CLV3 və STM RNT-nin in situ hibridləşməsi della mutantlarında meristemin genişlənməsini təsdiqlədi və kök hüceyrə yuvasının yan genişlənməsini daha da göstərdi (Əlavə Şəkil 13e, f, h, i). Lakin, SAM əyriliyi hər iki genotipdə oxşar idi (Əlavə Şəkil 13k, m, n, p). Vəhşi tiplə müqayisədə əyrilikdə dəyişiklik olmadan gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della dördqat mutantında ölçüdə oxşar artım müşahidə etdik (Əlavə Şəkil 13c, d, g, j, l, o, p). Hüceyrə bölünmə istiqamətinin tezliyi della dördqat mutantında da təsirləndi, lakin della monolitik mutantdan daha az dərəcədə (Əlavə Şəkil 12d–f). Bu doza effekti, əyriliyə təsirin olmaması ilə yanaşı, Della dördqat mutantında qalıq RGL3 aktivliyinin DELLA aktivliyinin itirilməsindən qaynaqlanan hüceyrə bölünmə istiqamətindəki dəyişiklikləri məhdudlaşdırdığını və yan hüceyrə bölünmələrindəki dəyişikliklərin SAM həndəsəsindəki dəyişikliklərdən daha çox GA siqnal aktivliyindəki dəyişikliklərə cavab olaraq baş verdiyini göstərir. Yuxarıda təsvir edildiyi kimi, CUC2 promotoru SAM-da P4-dən başlayaraq IPR ifadəsini idarə edir (Əlavə Şəkil 14a, b) və əksinə, pCUC2::gai-1-VENUS SAM-ın ölçüsü kiçildilmiş, lakin əyriliyi daha yüksək idi (Əlavə Şəkil 14c–h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasındakı bu dəyişiklik, yüksək çevrə gərginliklərinin SAM mərkəzindən daha qısa məsafədə başladığı vəhşi tiplə müqayisədə mexaniki gərginliklərin fərqli paylanmasına səbəb ola bilər47. Alternativ olaraq, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasındakı dəyişikliklər transgen ifadəsi ilə induksiya edilən regional mexaniki xüsusiyyətlərdəki dəyişikliklərdən qaynaqlana bilər48. Hər iki halda da, bu, müşahidələrimizi izah edərək, hüceyrələrin çevrə/eninə istiqamətdə bölünmə ehtimalını artırmaqla GA siqnalındakı dəyişikliklərin təsirlərini qismən kompensasiya edə bilər.
Ümumilikdə, məlumatlarımız daha yüksək GA siqnalının IPR-də hüceyrə bölünmə müstəvisinin yan istiqamətində aktiv rol oynadığını təsdiqləyir. Onlar həmçinin meristem əyriliyinin də IPR-də hüceyrə bölünmə müstəvisinin istiqamətində təsir etdiyini göstərir.
Yüksək GA siqnal aktivliyinə görə IPR-də bölmə müstəvisinin eninə istiqamətlənməsi, GA-nın epidermisdə SAM daxilində radial hüceyrə faylını əvvəlcədən təşkil etdiyini və sonradan epidermal internode-da tapılacaq hüceyrə təşkilatını təyin etdiyini göstərir. Həqiqətən də, bu cür hüceyrə faylları della global mutantlarının SAM şəkillərində tez-tez görünürdü (Şəkil 6b). Beləliklə, SAM-da GA siqnalının məkan modelinin inkişaf funksiyasını daha da araşdırmaq üçün vəhşi tipdə (Ler və Col-0), della global mutantlarında və pCUC2::gai-1-VENUS transgen bitkilərində IPR-dəki hüceyrələrin məkan təşkilatını təhlil etmək üçün zaman fasiləsi görüntüləməsindən istifadə etdik.
Biz qmRGA-nın IPR-də GA siqnal aktivliyinin P1/P2-dən artdığını və P4-də pik həddə çatdığını göstərdiyini və bu modelin zamanla sabit qaldığını aşkar etdik (Şəkil 4a–f və Əlavə Şəkil 8c–f, k). GA siqnalının artması ilə IPR-dəki hüceyrələrin məkan təşkilini təhlil etmək üçün, ilk müşahidədən 34 saat sonra təhlil edilən inkişaf taleyinə görə, yəni iki plastiddən çox dəfə təhlil edilən Ler IPR hüceyrələrini P4-ün yuxarısına və yanlarına etiketlədik və bu, P1/P2-dən P4-ə qədər primordium inkişafı zamanı IPR hüceyrələrini izləməyə imkan verdi. Üç fərqli rəngdən istifadə etdik: P4 yaxınlığında primordiuma inteqrasiya olunmuş hüceyrələr üçün sarı, IPR-də olanlar üçün yaşıl və hər iki prosesdə iştirak edənlər üçün bənövşəyi (Şəkil 7a–c). t0-da (0 saat) P4-ün qarşısında 1-2 təbəqə IPR hüceyrəsi görünürdü (Şəkil 7a). Gözlənildiyi kimi, bu hüceyrələr bölündükdə bunu əsasən eninə bölünmə müstəvisi vasitəsilə etdilər (Şəkil 7a–c). Oxşar nəticələr Col-0 SAM istifadə edilərək əldə edilmişdir (Ler-də P4-ə bənzər şəkildə qatlanan P3-ə diqqət yetirərək), baxmayaraq ki, bu genotipdə çiçək sərhədində əmələ gələn qat IPR hüceyrələrini daha tez gizlədir (Şəkil 7g–i). Beləliklə, IPR hüceyrələrinin bölünmə modeli hüceyrələri düyünlərarası cərgələrdə olduğu kimi radial cərgələrə əvvəlcədən təşkil edir. Radial cərgələrin təşkili və IPR hüceyrələrinin ardıcıl orqanlar arasında lokalizasiyası bu hüceyrələrin düyünlərarası progenitorlar olduğunu göstərir.
Burada, GA və GA reseptorlarının birləşmiş konsentrasiyalarından yaranan GA siqnal fəaliyyətinin kəmiyyət xəritələşdirilməsinə imkan verən, eyni zamanda endogen siqnal yollarına müdaxiləni minimuma endirən və bununla da hüceyrə səviyyəsində GA funksiyası haqqında məlumat verən nisbətometrik GA siqnal biosensoru, qmRGA hazırladıq. Bu məqsədlə, DELLA qarşılıqlı əlaqə tərəfdaşlarını bağlamaq qabiliyyətini itirmiş, lakin GA tərəfindən induksiya edilmiş proteolizə həssas qalan modifikasiya edilmiş DELLA zülalı, mRGA qurduq. qmRGA, GA səviyyələrində həm ekzogen, həm də endogen dəyişikliklərə cavab verir və onun dinamik sensor xüsusiyyətləri inkişaf zamanı GA siqnal fəaliyyətindəki məkan-zaman dəyişikliklərinin qiymətləndirilməsinə imkan verir. qmRGA həmçinin çox çevik bir vasitədir, çünki ifadəsi üçün istifadə olunan promotoru dəyişdirməklə (lazım gələrsə) müxtəlif toxumalara uyğunlaşdırıla bilər və GA siqnal yolunun və angiospermlər arasında PFYRE motivinin qorunmuş təbiəti nəzərə alınmaqla, digər növlərə ötürülməsi ehtimalı yüksəkdir22. Bununla uyğun olaraq, düyü SLR1 DELLA zülalındakı (HYY497AAA) ekvivalent mutasiya da SLR1-in böyümə repressor aktivliyini basdırdığı və mRGA23-ə bənzər şəkildə GA vasitəçiliyi ilə parçalanmasını bir qədər azaltdığı göstərilmişdir. Xüsusilə, Arabidopsis-də aparılan son tədqiqatlar PFYRE domenindəki (S474L) tək bir amin turşusu mutasiyasının RGA-nın transkripsiya faktoru tərəfdaşları ilə qarşılıqlı təsir qabiliyyətinə təsir etmədən transkripsiya aktivliyini dəyişdirdiyini göstərdi50. Bu mutasiya mRGA-da mövcud olan 3 amin turşusu əvəzlənməsinə çox yaxın olsa da, tədqiqatlarımız göstərir ki, bu iki mutasiya DELLA-nın fərqli xüsusiyyətlərini dəyişdirir. Transkripsiya faktoru tərəfdaşlarının əksəriyyəti DELLA26,51-in LHR1 və SAW domenlərinə bağlansa da, PFYRE domenindəki bəzi qorunan amin turşuları bu qarşılıqlı təsirləri sabitləşdirməyə kömək edə bilər.
Düyülərarası inkişaf bitki memarlığında və məhsuldarlığın artırılmasında əsas xüsusiyyətdir. qmRGA, IPR düyünlərarası progenitor hüceyrələrində daha yüksək GA siqnal aktivliyini aşkar etdi. Kəmiyyət görüntüləməsi və genetikanı birləşdirərək, GA siqnal nümunələrinin SAM epidermisində dairəvi/eninə hüceyrə bölünmə müstəvilərini üst-üstə qoyduğunu və düyünlərarası inkişaf üçün tələb olunan hüceyrə bölünmə təşkilatını formalaşdırdığını göstərdik. İnkişaf zamanı hüceyrə bölünmə müstəvisi istiqamətinin bir neçə tənzimləyicisi müəyyən edilmişdir52,53. İşimiz, GA siqnal aktivliyinin bu hüceyrə parametrini necə tənzimlədiyinə dair aydın bir nümunə təqdim edir. DELLA əvvəlcədən qatlanan protein kompleksləri ilə qarşılıqlı təsir göstərə bilər41, buna görə də GA siqnalı kortikal mikrotübül istiqamətinə birbaşa təsir göstərərək hüceyrə bölünmə müstəvisi istiqamətini tənzimləyə bilər40,41,54,55. Gözlənilmədən göstərdik ki, SAM-da daha yüksək GA siqnal aktivliyinin korrelyasiyası hüceyrə uzanması və ya bölünməsi deyil, yalnız böyümə anizotropiyasıdır ki, bu da GA-nın IPR-də hüceyrə bölünmə istiqamətinə birbaşa təsiri ilə uyğundur. Lakin, bu təsirin dolayı ola biləcəyini də istisna edə bilmərik, məsələn, GA tərəfindən induksiya edilmiş hüceyrə divarının yumşalması56 ilə vasitəçilik olunur. Hüceyrə divarının xüsusiyyətlərindəki dəyişikliklər mexaniki stressə səbəb olur57,58 ki, bu da kortikal mikrotübüllərin istiqamətinə təsir göstərərək hüceyrə bölünmə müstəvisinin istiqamətinə təsir göstərə bilər39,46,59. GA-nın yaratdığı mexaniki stressin və GA tərəfindən mikrotübül istiqamətinin birbaşa tənzimlənməsinin birləşmiş təsirləri, internodları təyin etmək üçün IPR-də hüceyrə bölünmə istiqamətinin spesifik bir nümunəsinin yaranmasında iştirak edə bilər və bu fikri sınaqdan keçirmək üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var. Eynilə, əvvəlki tədqiqatlar DELLA ilə qarşılıqlı təsir göstərən TCP14 və 15 zülallarının internod əmələ gəlməsinin idarə olunmasındakı əhəmiyyətini vurğulamışdır60,61 və bu amillər internod inkişafını tənzimləyən və GA siqnalına təsir göstərdiyi göstərilmişdir2,62 BREVIPEDICELLUS (BP) və PENNYWISE (PNY) ilə birlikdə GA-nın təsirini vasitəçilik edə bilər. DELL-lərin brassinosteroid, etilen, jasmon turşusu və absis turşusu (ABA) siqnal yolları ilə qarşılıqlı təsir göstərdiyi63,64 və bu hormonların mikrotübül istiqamətinə65 təsir göstərə biləcəyi nəzərə alındıqda, GA-nın hüceyrə bölünmə istiqamətinə təsiri digər hormonlar tərəfindən də vasitəçilik edilə bilər.
Erkən sitoloji tədqiqatlar göstərdi ki, Arabidopsis SAM-ın həm daxili, həm də xarici bölgələri düyünlərarası inkişaf üçün tələb olunur2,42. GA-nın daxili toxumalarda hüceyrə bölünməsini aktiv şəkildə tənzimləməsi12, SAM-da meristem və düyünlərarası ölçüsünün tənzimlənməsində GA-nın ikili funksiyasını dəstəkləyir. İstiqamətli hüceyrə bölünməsinin nümunəsi də daxili SAM toxumasında sıx şəkildə tənzimlənir və bu tənzimləmə kök böyüməsi üçün vacibdir52. GA-nın daxili SAM təşkilatında hüceyrə bölünmə müstəvisinin istiqamətləndirilməsində və bununla da SAM daxilində düyünlərarası düyünlərin spesifikasiyasını və inkişafını sinxronlaşdırmaqda rol oynayıb-oynamadığını araşdırmaq maraqlı olacaq.
Bitkilər, şitillərin şaquli lövhələrdə sabit işıq və 22 °C altında yetişdirildiyi hipokotil və kök böyüməsi təcrübələri istisna olmaqla, torpaqda və ya 1% saxaroza və 1% aqar (Sigma) ilə zənginləşdirilmiş 1x Murashige-Skoog (MS) mühitində (Duchefa) in vitro şəraitdə yetişdirilmişdir. Nitrat təcrübələri üçün bitkilər uzun gün şəraitində adekvat nitrat (0 və ya 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% saxaroza və 1% A-aqar (Sigma) ilə zənginləşdirilmiş modifikasiya olunmuş MS mühitində (bioWORLD bitki mühiti) yetişdirilmişdir.
pDONR221-ə daxil edilmiş GID1a kDNT-si, pUBQ10::GID1a-mCherry yaratmaq üçün pDONR P4-P1R-pUBQ10 və pDONR P2R-P3-mCherry ilə pB7m34GW-yə birləşdirilərək pUBQ10::GID1a-mCherry əmələ gətirildi. pDONR221-ə daxil edilmiş IDD2 DNT-si, p35S:IDD2-RFP yaratmaq üçün pB7RWG266-ya birləşdirildi. pGID1b::2xmTQ2-GID1b yaratmaq üçün, GID1b kodlaşdırma bölgəsinin yuxarı hissəsində 3,9 kb fraqment və GID1b cDNA (1,3 kb) və terminator (3,4 kb) ehtiva edən 4,7 kb fraqment əvvəlcə Əlavə Cədvəl 3-dəki praymerlərdən istifadə etməklə gücləndirilmiş, sonra müvafiq olaraq pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) və pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific)-ə daxil edilmiş və nəhayət, Gateway klonlaşdırmasından istifadə edərək pDONR221 2xmTQ268 ilə pGreen 012567 hədəf vektoruna rekombinasiya edilmişdir. pCUC2::LSSmOrange yaratmaq üçün CUC2 promotor ardıcıllığı (ATG-dən 3229 bp yuxarı), ardınca N7 nüvə lokalizasiya siqnalı və NOS transkripsiya terminatoru ilə böyük Stokes-shiftli mOrange (LSSmOrange)69 kodlaşdırma ardıcıllığı Gateway 3-fraqment rekombinasiya sistemi (Invitrogen) istifadə edərək pGreen kanamisin hədəf vektoruna yığılmışdır. Bitki binar vektoru Agrobacterium tumefaciens GV3101 ştammına daxil edilmiş və Agrobacterium infiltrasiya metodu ilə Nicotiana benthamiana yarpaqlarına və çiçəkli dip metodu ilə Arabidopsis thaliana Col-0-a daxil edilmişdir. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry və pCLV3::mCherry-NLS qmRGA müvafiq çarpazlaşmaların F3 və F1 nəsillərindən təcrid olunmuşdur.
RNT-nin yerində hibridləşdirilməsi təxminən 1 sm uzunluğunda tumurcuq uclarında aparıldı72, bunlar toplandı və dərhal 4 °C-yə qədər əvvəlcədən soyudulmuş FAA məhlulunda (3,7% formaldehid, 5% sirkə turşusu, 50% etanol) fiksasiya edildi. 2 × 15 dəqiqəlik vakuum müalicəsindən sonra fiksator dəyişdirildi və nümunələr bir gecədə inkubasiya edildi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 və RGL3 kDNT-ləri və antisens zondları Rosier və digərləri tərəfindən təsvir edildiyi kimi Əlavə Cədvəl 3-də göstərilən praymerlərdən istifadə edərək sintez edildi73. Diqoksigeninlə işarələnmiş zondlar diqoksigenin antikorları (3000 qat durulaşdırma; Roche, kataloq nömrəsi: 11 093 274 910) istifadə edilərək immunodeteksiya edildi və kəsiklər 5-bromo-4-xlor-3-indolil fosfat (BCIP, 250 qat durulaşdırma)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200 qat durulaşdırma) məhlulu ilə boyandı.
Yayımlanma vaxtı: 10 Fevral 2025