Antelmintik dərman N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE (asetilxolinesteraz) inhibə etdiyi və həddindən artıq vaskulyarizasiyaya görə potensial kanserogen xüsusiyyətlərə malik olduğu bildirilmişdir. Bu yazıda biz göstəririk ki, DEET xüsusi olaraq angiogenezi təşviq edən endotel hüceyrələrini stimullaşdırır və bununla da şiş böyüməsini artırır. DEET proliferasiya, miqrasiya və yapışma da daxil olmaqla angiogenezə aparan hüceyrə proseslərini aktivləşdirir. Bu, endotel hüceyrələrində artan NO istehsalı və VEGF ifadəsi ilə əlaqələndirilir. M3-ün susdurulması və ya farmakoloji M3 inhibitorlarının istifadəsi bütün bu təsirləri ləğv etdi və DEET-in səbəb olduğu angiogenezin M3-ə həssas olduğunu göstərir. M3 reseptorlarını həddindən artıq ifadə edən endotel və HEK hüceyrələrində kalsium siqnalı ilə bağlı təcrübələr, həmçinin bağlama və yerləşdirmə tədqiqatları göstərir ki, DEET M3 reseptorlarının allosterik modulyatoru kimi çıxış edir. Bundan əlavə, DEET AChE-ni inhibə edir, bununla da asetilkolin və onun M3 reseptorlarına bağlanma qabiliyyətini artırır və allosterik tənzimləmə vasitəsilə proangiogen təsirləri artırır.
İlkin EC-lər İsveçrə siçanlarının aortasından təcrid edilmişdir. Ekstraksiya üsulu Kobayaşi protokolundan 26 uyğunlaşdırılmışdır. Sıçan EC-ləri dördüncü keçidə qədər 5% istiliklə təsirsizləşdirilmiş FBS ilə əlavə edilmiş EBM-2 mühitində becərildi.
HUVEC, U87MG və ya BF16F10-un yayılmasına iki DEET konsentrasiyasının təsiri CyQUANT Hüceyrə Proliferasiyası Təhlil Kitindən (Molekulyar Problar, C7026) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Qısaca olaraq, hər quyuya 5,103 hüceyrə 96 quyu boşqabına səpildi, bir gecədə yapışdırıldı və sonra 24 saat ərzində DEET ilə müalicə olundu. Artan mühiti çıxardıqdan sonra mikroplağın hər bir quyusuna boya bağlayan məhlul əlavə edin və hüceyrələri 37 °C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin. Floresans səviyyələri 485 nm həyəcan filtrləri və 530 nm emissiya filtrləri ilə təchiz edilmiş Mithras LB940 çox rejimli mikroplitə oxuyucusu (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almaniya) istifadə edərək müəyyən edilmişdir.
HUVEC hər quyuya 104 hüceyrə sıxlığında 96 quyu boşqablarına səpildi. Hüceyrələr 24 saat ərzində DEET ilə müalicə olundu. Hüceyrə canlılığı kolorimetrik MTT analizindən istifadə etməklə qiymətləndirilmişdir (Sigma-Aldrich, M5655). Optik sıxlıq dəyərləri 570 nm dalğa uzunluğunda çox rejimli mikroplit oxuyucuda (Mithras LB940) əldə edilmişdir.
DEET-in təsirləri in vitro angiogenez analizlərindən istifadə etməklə tədqiq edilmişdir. 10-8 M və ya 10-5 M DEET ilə müalicə HUVEC-lərdə kapilyar uzunluğun formalaşmasını artırdı (Şəkil 1a, b, ağ çubuqlar). Nəzarət qrupu ilə müqayisədə, 10-14 ilə 10-5 M arasında dəyişən DEET konsentrasiyası ilə müalicə kapilyar uzunluğunun 10-8 M DEET-də yaylaya çatdığını göstərdi (Əlavə Şəkil S2). 10-8 M və 10-5 M konsentrasiya diapazonunda DEET ilə müalicə olunan HUVEC-lərin in vitro proangiogen təsirində əhəmiyyətli fərq aşkar edilməmişdir.
DEET-in neovaskulyarizasiyaya təsirini müəyyən etmək üçün biz in vivo neovaskulyarizasiya tədqiqatları apardıq. 14 gündən sonra, 10-8 M və ya 10-5 M DEET ilə prekulturasiya edilmiş endotel hüceyrələri ilə enjekte edilmiş siçanlar hemoglobin məzmununda əhəmiyyətli bir artım göstərdi (Şəkil 1c, ağ çubuqlar).
Bundan əlavə, DEET-in səbəb olduğu neovaskulyarizasiya, məruz qalmış insanlarda normal olan 10-5 M plazma konsentrasiyasına səbəb olduğu bilinən bir dozada gündəlik (ip) DEET enjekte edilmiş U87MG ksenoqraft daşıyan siçanlarda tədqiq edilmişdir. 23-də. Aşkarlana bilən şişlər (yəni >100 mm3 şişlər) U87MG hüceyrələrinin siçanlara yeridilməsindən 14 gün sonra müşahidə edilmişdir. 28-ci gündə, nəzarət siçanları ilə müqayisədə DEET ilə müalicə olunan siçanlarda şiş böyüməsi əhəmiyyətli dərəcədə artırıldı (Şəkil 1d, kvadratlar). Bundan əlavə, şişlərin CD31 boyanması DEET-in kapilyar sahəni əhəmiyyətli dərəcədə artırdığını, lakin mikrodamar sıxlığını artırmadığını göstərdi. (şək. 1e–g).
DETA-nın yaratdığı proliferasiyada muskarinik reseptorların rolunu müəyyən etmək üçün pFHHSiD (10-7 M, selektiv M3 reseptor antaqonisti) varlığında 10-8 M və ya 10-5 M DETA istifadə edilmişdir. HUVEC müalicəsi. pFHHSiD bütün konsentrasiyalarda DETA-nın proliferativ xassələrini tamamilə blokladı (Cədvəl 1).
Bu şərtlər altında, DEET-in HUVEC hüceyrələrində kapilyar uzunluğu artırıb artırmayacağını da araşdırdıq. Eynilə, pFHHSiD əhəmiyyətli dərəcədə DEET səbəb olan kapilyar uzunluğunun qarşısını aldı (Şəkil 1a, b, boz çubuqlar). Bundan əlavə, oxşar təcrübələr M3 siRNA ilə aparılmışdır. Nəzarət siRNA kapilyar əmələ gəlməsinin təşviqində təsirli olmasa da, M3 muskarinik reseptorunun susdurulması DEET-in kapilyar uzunluğunu artırmaq qabiliyyətini ləğv etdi (Şəkil 1a, b, qara çubuqlar).
Bundan əlavə, həm 10-8 M, həm də 10-5 M DEET ilə induksiya edilmiş in vitro vaskulyarizasiya və in vivo neovaskulyarizasiya pFHHSiD tərəfindən tamamilə bloklandı (Şəkil 1c, d, dairələr). Bu nəticələr göstərir ki, DEET selektiv M3 reseptor antaqonistlərinə və ya M3 siRNA-ya həssas olan bir yol vasitəsilə angiogenezi təşviq edir.
AChE DEET-in molekulyar hədəfidir. AChE inhibitorları kimi fəaliyyət göstərən donepezil kimi dərmanlar in vitro və siçan arxa ayağının işemiya modellərində EC angiogenezini stimullaşdıra bilər14. HUVEC-də iki DEET konsentrasiyasının AChE ferment aktivliyinə təsirini sınaqdan keçirdik. DEET-in aşağı (10-8 M) və yüksək (10-5 M) konsentrasiyası nəzarət şərtləri ilə müqayisədə endotelial AChE fəaliyyətini azaldır (Şəkil 2).
DEET-in hər iki konsentrasiyası (10-8 M və 10-5 M) HUVEC-də asetilkolinesterazın aktivliyini azaldır. BW284c51 (10-5 M) asetilkolinesteraza inhibitorları üçün nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Nəticələr nəqliyyat vasitəsi ilə müalicə olunan hüceyrələrlə müqayisədə iki DEET konsentrasiyası ilə işlənmiş HUVEC-də AChE aktivliyinin faizi kimi ifadə edilir. Dəyərlər altı müstəqil təcrübənin orta ± SEM kimi ifadə edilir. *p < 0,05 nəzarət ilə müqayisədə (Kruskal-Wallis və Dunn çoxlu müqayisə testi).
Azot oksidi (NO) angiogenik prosesdə iştirak edir 33, buna görə də DEET ilə stimullaşdırılmış HUVEC-lərdə NO istehsalı tədqiq edilmişdir. DEET ilə müalicə olunan endotel NO istehsalı nəzarət hüceyrələri ilə müqayisədə artdı, lakin yalnız 10-8 M dozada əhəmiyyət kəsb etdi (Şəkil 3c). DEET-in induksiya etdiyi NO istehsalına nəzarət edən molekulyar dəyişiklikləri müəyyən etmək üçün eNOS ifadəsi və aktivləşdirilməsi Western blot üsulu ilə təhlil edilmişdir. DEET müalicəsi eNOS ifadəsini dəyişdirməsə də, eNOS fosforilasiyasında müalicə olunmamış hüceyrələrlə müqayisədə onun aktivləşdirici yerində (Ser-1177) eNOS fosforlaşmasını əhəmiyyətli dərəcədə artırdı, eyni zamanda inhibitor sahəsini (Thr-495) azaldıb (Şəkil 3d). Bundan əlavə, fosforlanmış eNOS-un aktivləşmə yerində və inhibitor sahəsindəki nisbəti fosforlanmış eNOS-un miqdarını fermentin ümumi miqdarına normallaşdırdıqdan sonra hesablanmışdır. Bu nisbət təmizlənməmiş hüceyrələrlə müqayisədə hər bir DEET konsentrasiyası ilə müalicə olunan HUVEC-lərdə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 3d).
Nəhayət, əsas proangiogen faktorlardan biri olan VEGF-nin ifadəsi Western blotting üsulu ilə təhlil edilmişdir. DEET VEGF ifadəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı, pFHHSiD isə bu ifadəni tamamilə blokladı.
DEET-in təsiri həm farmakoloji blokadaya, həm də M3 reseptorlarının aşağı tənzimlənməsinə həssas olduğundan, biz DEET-in kalsium siqnalını gücləndirə biləcəyi fərziyyəsini sınaqdan keçirdik. Təəccüblüdür ki, DEET istifadə edilən hər iki konsentrasiya üçün HUVEC (məlumatlar göstərilmir) və HEK/M3-də (Şəkil 4a, b) sitoplazmik kalsiumu artıra bilmədi.
Göndərmə vaxtı: 30 dekabr 2024-cü il