Antihelmintik dərman N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE-ni (asetilkolinesteraza) inhibə etdiyi və həddindən artıq vaskulyarizasiya səbəbindən potensial kanserogen xüsusiyyətlərə malik olduğu bildirilir. Bu məqalədə biz DEET-in xüsusilə angiogenezi təşviq edən endotel hüceyrələrini stimullaşdırdığını və bununla da şiş böyüməsini artırdığını göstəririk. DEET, proliferasiya, miqrasiya və adgeziya da daxil olmaqla, angiogenezə aparan hüceyrə proseslərini aktivləşdirir. Bu, endotel hüceyrələrində NO istehsalının və VEGF ifadəsinin artması ilə əlaqələndirilir. M3-ün susdurulması və ya farmakoloji M3 inhibitorlarının istifadəsi bütün bu təsirləri aradan qaldırır və bu da DEET-in induksiya etdiyi angiogenezin M3-ə həssas olduğunu göstərir. M3 reseptorlarını həddindən artıq ifadə edən endotel və HEK hüceyrələrində kalsium siqnalını əhatə edən təcrübələr, eləcə də bağlanma və doklama tədqiqatları göstərir ki, DEET M3 reseptorlarının allosterik modulyatoru kimi çıxış edir. Bundan əlavə, DEET AChE-ni inhibə edir və bununla da asetilkolinin biomənimsənilməsini və onun M3 reseptorlarına bağlanmasını artırır və allosterik tənzimləmə vasitəsilə proangiogen təsirləri artırır.
İlkin EK-lər İsveçrə siçanlarının aortasından təcrid olunmuşdur. Ekstraksiya metodu Kobayashi protokolundan 26 uyğunlaşdırılmışdır. Siçan EK-ləri dördüncü keçidə qədər 5% istiliklə inaktivləşdirilmiş FBS ilə zənginləşdirilmiş EBM-2 mühitində becərilmişdir.
İki konsentrasiyada DEET-in HUVEC, U87MG və ya BF16F10 proliferasiyasına təsiri CyQUANT Hüceyrə Proliferasiyası Təhlili Dəsti (Molecular Probes, C7026) istifadə edilərək təhlil edilmişdir. Qısaca desək, hər quyuya 5.103 hüceyrə 96 quyulu lövhəyə əkilmiş, bir gecədə yapışdırılmasına icazə verilmiş və sonra 24 saat ərzində DEET ilə işlənmişdir. Böyümə mühiti çıxarıldıqdan sonra mikroplakanın hər quyusuna boya bağlayıcı məhlul əlavə edin və hüceyrələri 37 °C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin. Flüoresensiya səviyyələri 485 nm həyəcan filtrləri və 530 nm emissiya filtrləri ilə təchiz olunmuş Mithras LB940 çoxmodlu mikroplak oxuyucusu (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Almaniya) istifadə edilərək müəyyən edilmişdir.
HUVEC, hər quyuda 104 hüceyrə sıxlığı ilə 96 quyulu lövhələrə əkildi. Hüceyrələr 24 saat ərzində DEET ilə müalicə edildi. Hüceyrənin canlılığı kolorimetrik MTT analizi (Sigma-Aldrich, M5655) istifadə edilərək qiymətləndirildi. Optik sıxlıq dəyərləri 570 nm dalğa uzunluğunda çoxmodlu mikroplitə oxuyucusunda (Mithras LB940) əldə edildi.
DEET-in təsirləri in vitro angiogenez testləri ilə öyrənilmişdir. 10-8 M və ya 10-5 M DEET ilə müalicə HUVEC-lərdə kapilyar uzunluğunun əmələ gəlməsini artırmışdır (Şəkil 1a, b, ağ zolaqlar). Nəzarət qrupu ilə müqayisədə, 10-14 ilə 10-5 M arasında dəyişən DEET konsentrasiyaları ilə müalicə kapilyar uzunluğunun 10-8 M DEET-də platoya çatdığını göstərdi (Əlavə Şəkil S2). 10-8 M və 10-5 M konsentrasiya diapazonunda DEET ilə müalicə olunan HUVEC-lərin in vitro proangiogen təsirində heç bir əhəmiyyətli fərq aşkar edilməmişdir.
DEET-in neovaskulyarizasiyaya təsirini müəyyən etmək üçün in vivo neovaskulyarizasiya tədqiqatları apardıq. 14 gündən sonra 10-8 M və ya 10-5 M DEET ilə əvvəlcədən becərilən endotel hüceyrələri yeridilən siçanlarda hemoglobin tərkibində əhəmiyyətli dərəcədə artım müşahidə edildi (Şəkil 1c, ağ zolaqlar).
Bundan əlavə, DEET-in yaratdığı neovaskulyarizasiya U87MG ksenotransplantat daşıyan siçanlarda öyrənilmişdir. Bu siçanlara gündəlik olaraq 10-5 M plazma konsentrasiyalarını induksiya etdiyi bilinən bir dozada DEET vurulmuşdur ki, bu da 23-də təsirə məruz qalan insanlarda normaldır. Aşkar edilə bilən şişlər (yəni >100 mm3 şişlər) siçanlara U87MG hüceyrələrinin vurulmasından 14 gün sonra müşahidə edilmişdir. 28-ci gündə DEET ilə müalicə olunmuş siçanlarda şiş böyüməsi nəzarət siçanları ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 1d, kvadratlar). Bundan əlavə, şişlərin CD31 boyanması göstərdi ki, DEET kapilyar sahəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırıb, lakin mikrodamar sıxlığını artırmayıb. (Şəkil 1e–g).
Muskarin reseptorlarının DETA ilə induksiya olunmuş proliferasiyadakı rolunu müəyyən etmək üçün pFHHSiD (10-7 M, selektiv M3 reseptor antaqonisti) iştirakı ilə 10-8 M və ya 10-5 M DETA istifadə edilmişdir. HUVEC ilə müalicə. pFHHSiD bütün konsentrasiyalarda DETA-nın proliferativ xüsusiyyətlərini tamamilə bloklamışdır (Cədvəl 1).
Bu şərtlər altında, DEET-in HUVEC hüceyrələrində kapilyar uzunluğunu artırıb-artırmayacağını da araşdırdıq. Eynilə, pFHHSiD DEET-in induksiya etdiyi kapilyar uzunluğun qarşısını əhəmiyyətli dərəcədə aldı (Şəkil 1a, b, boz zolaqlar). Bundan əlavə, oxşar təcrübələr M3 siRNA ilə də aparıldı. Nəzarət siRNA-sı kapilyar əmələ gəlməsini təşviq etməkdə təsirli olmasa da, M3 muskarin reseptorunun susdurulması DEET-in kapilyar uzunluğunu artırmaq qabiliyyətini ləğv etdi (Şəkil 1a, b, qara zolaqlar).
Bundan əlavə, həm 10-8 M, həm də 10-5 M DEET ilə induksiya edilmiş in vitro vaskulyarizasiya, həm də neovaskulyarizasiya in vivo pFHHSiD tərəfindən tamamilə bloklanmışdır (Şəkil 1c, d, dairələr). Bu nəticələr göstərir ki, DEET selektiv M3 reseptor antaqonistlərinə və ya M3 siRNA-ya həssas olan bir yol vasitəsilə angiogenezi təşviq edir.
AChE DEET-in molekulyar hədəfidir. AChE inhibitorları kimi çıxış edən donepezil kimi dərmanlar, in vitro və siçan arxa ətraf işemiyası modellərində EC angiogenezini stimullaşdıra bilər14. HUVEC-də iki konsentrasiyada DEET-in AChE ferment aktivliyinə təsirini sınaqdan keçirdik. DEET-in aşağı (10-8 M) və yüksək (10-5 M) konsentrasiyaları nəzarət şərtləri ilə müqayisədə endotel AChE aktivliyini azaltdı (Şəkil 2).
Hər iki DEET konsentrasiyası (10-8 M və 10-5 M) HUVEC üzərində asetilkolinesteraza aktivliyini azaltdı. BW284c51 (10-5 M) asetilkolinesteraza inhibitorları üçün nəzarət kimi istifadə edilmişdir. Nəticələr, HUVEC üzərində iki DEET konsentrasiyası ilə müalicə olunmuş AChE aktivliyinin vasitə ilə müalicə olunmuş hüceyrələrlə müqayisədə faizi kimi ifadə edilir. Dəyərlər altı müstəqil təcrübənin orta ± SEM-i kimi ifadə edilir. *p < 0.05, nəzarətlə müqayisədə (Kruskal-Wallis və Dunn çoxsaylı müqayisə testi).
Azot oksidi (NO) angiogen prosesdə 33 iştirak edir, buna görə də DEET ilə stimullaşdırılmış HUVEC-lərdə NO istehsalı öyrənilmişdir. DEET ilə müalicə olunmuş endotel NO istehsalı nəzarət hüceyrələri ilə müqayisədə artmış, lakin yalnız 10-8 M dozada əhəmiyyətə çatmışdır (Şəkil 3c). DEET ilə induksiya edilmiş NO istehsalını idarə edən molekulyar dəyişiklikləri müəyyən etmək üçün eNOS ifadəsi və aktivləşməsi Western blotting ilə təhlil edilmişdir. DEET müalicəsi eNOS ifadəsini dəyişdirməsə də, eNOS fosforlaşmasında müalicə olunmamış hüceyrələrlə müqayisədə aktivləşmə yerində (Ser-1177) eNOS fosforlaşmasını əhəmiyyətli dərəcədə artırmış və inhibitor yerini (Thr-495) azaltmışdır (Şəkil 3d). Bundan əlavə, aktivləşmə yerində və inhibitor yerində fosforlanmış eNOS-un nisbəti fosforlanmış eNOS miqdarının fermentin ümumi miqdarına normallaşdırılmasından sonra hesablanmışdır. Bu nisbət müalicə olunmamış hüceyrələrlə müqayisədə hər DEET konsentrasiyası ilə müalicə olunmuş HUVEC-lərdə əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 3d).
Nəhayət, əsas proangiogen amillərdən biri olan VEGF-in ifadəsi Western blotting ilə təhlil edildi. DEET VEGF ifadəsini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı, pFHHSiD isə bu ifadəni tamamilə blokladı.
DEET-in təsirləri həm farmakoloji blokadaya, həm də M3 reseptorlarının aşağı tənzimlənməsinə həssas olduğundan, DEET-in kalsium siqnalını gücləndirə biləcəyi fərziyyəsini sınaqdan keçirdik. Təəccüblüdür ki, DEET istifadə edilən hər iki konsentrasiya üçün HUVEC (məlumatlar göstərilməyib) və HEK/M3-də (Şəkil 4a, b) sitoplazmatik kalsiumu artıra bilmədi.
Yazı vaxtı: 30 Dekabr 2024