Pestisidlər qlobal qida çatışmazlığının aradan qaldırılmasında və vektorlardan keçən insan xəstəlikləri ilə mübarizədə mühüm rol oynayır. Lakin, pestisidlərə qarşı müqavimətin artan problemi təcili olaraq az istifadə edilən hədəfləri hədəf alan yeni birləşmələrin kəşfini tələb edir. Həşəratların keçici reseptor potensialı (TRPV) kanalları — Nanzhong (Nan) və qeyri-aktiv (Iav) — heteroloji kanallar (Nan-Iav) əmələ gətirə və həşəratlarda geotropizm, eşitmə və propriosepsiyanı vasitəçilik edən mexanosensor orqanlarda lokallaşa bilər. Aphidopirrolidon (AP) kimi bəzi pestisidlər naməlum mexanizmlər vasitəsilə Nan-Iav-ı hədəf alır. AP, deşici əmici həşəratlara (hemipterans) qarşı təsirlidir və filamentlərin funksiyasını pozaraq qidalanmanın qarşısını alır. AP yalnız Nan-Iav ilə birləşə bilər, lakin yalnız Nan-Iav endogen nikotinamid (NAM) da daxil olmaqla agonistlərlə qarşılıqlı təsir göstərə bilər və bununla da kanal aktivliyi nümayiş etdirir. Nan-Iav-ın insektisid hədəfi kimi potensialına baxmayaraq, onun kanal yığılması, tənzimləyici bağlanma yerləri və Ca2+-asılı tənzimlənməsi haqqında az məlumat var ki, bu da insektisidlərin daha da inkişafına mane olur. Bu tədqiqatda, krio-elektron mikroskopiyası Hemiptera həşəratlarında Nan-Iav-ın kalmodulin-liqandsız vəziyyətdə, eləcə də ankirin təkrar sitoplazmatik domeninin (ARD) sərhədində AP və NAM ilə birlikdə strukturunu təyin etmək üçün istifadə edilmişdir. Təəccüblüdür ki, Nan zülalının özünün AP vasitəçiliyi ilə ARD qarşılıqlı təsirləri ilə sabitləşən bir pentamer əmələ gətirə biləcəyini aşkar etdik. Bu tədqiqat insektisidlər və agonistlər və Nan-Iav arasında molekulyar qarşılıqlı təsirləri aşkar edir, ARD-nin kanal funksiyası və yığılmasındakı əhəmiyyətini vurğulayır və Ca2+ tənzimlənməsinin mexanizmini araşdırır.
Getdikcə daha da şiddətlənən qlobal iqlim dəyişikliyi fonunda qlobal ərzaq təhlükəsizliyinin pisləşməsi 21-ci əsrin əsas problemlərindən biridir və cəmiyyət üçün kaskad nəticələri ilə müşayiət olunur.1,2Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatının 2023-cü ildə Dünyada Ərzaq Təhlükəsizliyi və Qidalanma Vəziyyəti (SOFI) hesabatında dünyada təxminən 2,33 milyard insanın orta və ağır qida çatışmazlığından əziyyət çəkdiyi və bu, uzun müddətdir davam edən bir problem olduğu təxmin edilir.3,4Təəssüf ki, hər il məhsuldarlığın təxminən 20%-dən 30%-ə qədəri və ya daha çoxu zərərvericilər və patogenlər tərəfindən itirilir və qlobal istiləşmənin zərərvericilərə qarşı müqaviməti və məhsulun həssaslığını artıracağı gözlənilir.4,5,6,7,8Pestisidlərin hazırlanması təkcə bitkiləri zərərvericilərdən qorumaq və vektor vasitəsilə ötürülən patogenlərin yayılmasını azaltmaq üçün deyil, həm də pestisidlərə qarşı getdikcə daha davamlı olan denge qızdırması, malyariya və Çaqas xəstəliyi kimi vektor vasitəsilə ötürülən insan xəstəlikləri ilə mübarizə aparmaq üçün vacibdir.5,9,10,11
Neyrotoksik insektisidlərin əsas hədəfləri arasında, heterotetramerik TRPV kanalı Nanchung (Nan)-Inactive (Iav), yalnız son on ildə kəşf edilmiş insektisid hədəfləri sinfini təmsil edir, o cümlədən imidakloprid və piraklostrobin kimi ticari olaraq mövcud olan insektisidlər.12,13,14Yarısintetik insektisid aphidopirrolifen (AP), əsas komponenti AP-ni subnanomolyar aktivlik səviyyəsində bağlayan aktiv insektisid Inscalis® olan bu yaxınlarda hazırlanmış və kommersiyalaşdırılmış bir məhsuldur.15AP tozlandırıcılara, faydalı həşəratlara və digər hədəf olmayan orqanizmlərə qarşı aşağı kəskin toksiklik nümayiş etdirir və etiketdəki təlimatlara uyğun istifadə edildikdə, digər insektisidlərə qarşı müqavimət təzyiqini azalda bilər.16,17,18Nan və Iav həşərat növləri arasında geniş yayılmışdır, yalnız antenaların və ətrafların xordal uzanan reseptor neyronlarında birgə ifadə olunur və eşitmə, cazibə qavrayışı və propriosepsiya üçün vacibdir.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprid və piraklostrobin unikal mexanizm vasitəsilə Nan-Iav kompleksini stimullaşdırır və nəticədə proprioseptiv siqnal ötürülməsini inhibə edir.13,16,23Məndələr və ağ milçəklər kimi deşici əmici həşəratlarda (hemipterans) propriosepsiyanın itirilməsi onların qidalanma qabiliyyətini pozur və nəticədə ölümə səbəb olur.13,24Maraqlıdır ki, AP Nan-Iav kompleksinə yüksək, yalnız Nana isə aşağı yaxınlıq nümayiş etdirir. AP-nin Nan-Iav-a bağlanması elektrik cərəyanına səbəb olur, lakin yalnız Nana bağlanması kanal fəaliyyətini stimullaşdırmır. Iav özü isə ümumiyyətlə AP-yə bağlanmır.16Bu, Nan və Iav-ın fərqli Nan-Iav kanal kompleksləri əmələ gətirmək üçün birləşə biləcəyini (məsələn, fərqli stexiometrik nisbətlərlə və ya eyni stexiometrik nisbət daxilində fərqli tənzimləmələrlə) və ya AP-nin birdən çox yerə bağlana biləcəyini göstərir. Bundan əlavə, təbii agonist nikotinamid (NAM) mikromolyar affinliklə Drosophila Nan-Iav-a bağlanır və in vitro bitlərin (AP) təsirlərinə bənzər təsirlər göstərir.16,25və bitlərin çoxalmasını və qidalanmasını maneə törədir, nəticədə onların ölümünə səbəb olur25,26Bu məlumatlar bir çox sual doğurur. Məsələn, Nan-Iav heterodimerinin necə əmələ gəldiyi, kiçik molekulları modulyasiya etmək üçün hansı bağlanma yerlərindən istifadə edildiyi və bu kiçik molekulların propriosepsiyanı boğaraq kanal funksiyasını necə tənzimlədiyi hələ də aydın deyil. Bundan əlavə, Nan-Iav heterodimerinin aktiv olduğu və AP-yə daha yüksək affinliklə bağlandığı halda, Nan-Iav-ın özünün qeyri-aktiv və AP-yə aşağı affinliyə malik olmasının səbəbləri hələ də aydın deyil. Nəhayət, Nan-Iav funksiyasının Ca2+-asılı tənzimlənməsi və onun neyron siqnal proseslərinə necə inteqrasiya olunması haqqında az şey məlumdur.. 13,21
Bu tədqiqatda, krio-elektron mikroskopiyası, elektrofiziologiya və radioliqand bağlanma texnikalarını birləşdirərək, Nan-Iav-ın yığılmasını və onun kiçik molekul tənzimləyicilərinə bağlanma mexanizmini aydınlaşdırdıq. Bundan əlavə, Iav və AP-stabilləşdirilmiş Nan pentamerlərinə konstitutiv şəkildə bağlı kalmodulin (CaM) aşkar etdik. Bu nəticələr kanallarda kalsium ionlarının tənzimlənməsi, kanal yığılması və ligand bağlanma affinliyini müəyyən edən amillər barədə mühüm məlumatlar verir. Daha da əhəmiyyətlisi, ARD-nin bu proseslərdə mərkəzi rol oynadığını təsdiqlədik. Müvafiq kənd təsərrüfatı pestisidlərinə bağlı tam həşərat kanallarının tədqiqatımız.27, 28, 29pestisid sənayesinin inkişafı üçün perspektivlər açır, pestisidlərin effektivliyini və spesifikliyini artırır və qlobal ərzaq təhlükəsizliyi və vektor vasitəsilə ötürülən xəstəliklərin yayılması problemlərinin həlli üçün TRPV hədəfli birləşmələrin digər növlərə tətbiqinə imkan yaradır.
Həmçinin, Nan-Iav-ın Ca2+ tərəfindən tənzimləndiyini və tənzimləmə mexanizminin konstitutiv olaraq bağlı CaM tərəfindən vasitəçilik edildiyini aşkar etdik. Əhəmiyyətli olan odur ki, CaM tərəfindən Nav-ın bu Ca2+-asılı tənzimlənməsi digər ion kanallarının (məsələn, gərginliklə idarə olunan Na+ kanalları və TRPV5/6 kanalları) tənzimlənmə mexanizmlərindən əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənir.52,53,54,55,56,57Nav1.2 kanalında CaM-in C-terminal domeni spiral şəkildə C-terminal domeni (CTD) ilə əlaqələndirilir və Ca2+ öz N-terminal domeninin CTD-nin distal hissəsinə bağlanmasına səbəb olur.56TRPV5/6 kanalında CaM-in C-terminal domeni CTH-yə bağlanır və Ca2+ öz N-terminal domeninin məsaməyə yuxarı doğru uzanmasına səbəb olur və bununla da kation keçiriciliyini bloklayır.53,54Nan-Iav-CaM-in Ca2+ ilə tənzimlənən funksiyası üçün bir model təklif edirik (Şəkil 4h). Bu modeldə CaM-in N-terminal domeni Iav-in C-terminal domeninə (CTH) konstitutiv şəkildə bağlanır. Sakit vəziyyətdə (aşağı [Ca2+] konsentrasiyası), CaM-in C-terminal domeni Nan ilə qarşılıqlı təsir göstərir, ARD konformasiyasını sabitləşdirir və bununla da kanalın açılmasını təşviq edir. Agonist/insektisid kanala bağlanması məsamələrin açılmasına səbəb olur və bu da Ca2+ axınına səbəb olur. Daha sonra Ca2+ CaM-ə bağlanır və C-terminal domeninin Nan-in ARD-dən ayrılmasına səbəb olur. CaM bağlanmasının bloklanması Ca2+-in inhibitor təsirini mahiyyətcə aradan qaldırdığı üçün bu ayrılma ARD hərəkətliliyini modulyasiya edir və bununla da Ca2+-dən asılı inhibə və ya desensitizasiyaya səbəb olur. Kalsium ionlarının elusiyasından sonra kanal cərəyanlarının sürətli bərpası (Şəkil 4g) bu mexanizmin Ca2+ vasitəçiliyi ilə neyron siqnallarına sürətli reaksiyaları asanlaşdırdığını göstərir. Bundan əlavə, hələ də az öyrənilmiş Iav-ın C-terminal bölgəsinin kanal hədəfləməsində və mövcud tənzimləmədə digər rol oynadığı bildirilir.21
Nəhayət, tədqiqatımız kənd təsərrüfatı əhəmiyyətli insektisid-insektisid TRP kanal kompleksinin yüksək dəqiqlikli strukturunu təqdim edir - bu, əvvəllər bizə məlum olmayan bir kəşfdir. Xüsusilə, biz həşərat kanalının həşərat hüceyrələrində deyil, insan hüceyrələrində (HEK293S GnTi–) strukturunu və funksiyasını xarakterizə etdik. Artan insektisid müqaviməti və qida təhlükəsizliyi və patogenlərə davamlı təzyiq qarşısında işimiz insan sağlamlığı və qlobal qida təhlükəsizliyi üçün yeni insektisidlərin hazırlanmasını asanlaşdıracaq vacib məlumatlar təqdim edir. Tədqiqatlar göstərir ki, AP kimi insektisidlər etiket təlimatlarına uyğun istifadə edildikdə bəzi zərərvericilərə qarşı təsirlidir və faydalı tozlandırıcılar üçün aşağı kəskin toksikliyə malikdir, bu da onların ekoloji təhlükəsizliyini nümayiş etdirir.13,16Bundan əlavə, bəzi AP törəmələrinin ağcaqanadlar üzərində sınaqdan keçirilməsi göstərib ki, onlar nəticədə uçmaq qabiliyyətini itirirlər. Bu modulyasiyaedici birləşmələrin Nan-Iav-a necə bağlandığını anlamaq mövcud birləşmələrin modifikasiyasını və ya daha effektiv və effektiv şəkildə yeni birləşmələrin hazırlanmasını asanlaşdıracaq.dəqiqzərərvericilərə qarşı mübarizə. Tədqiqatımız göstərir ki, Nan-Iav ARD interfeysi yalnız endogen birləşmələrin, pestisidlərin və Ca2+-CaM-in aktivliyinin tənzimlənməsi üçün deyil, həm də kanal yığılması üçün vacibdir. Biz kiçik molekullarla heterodimer yığılmasının pozulmasının ion kanalı inhibitorlarının hazırlanması üçün unikal və perspektivli bir yanaşma ola biləcəyini düşünürük.
Səkkiz ortoloji gendən, yuyucu vasitələrdə əla stabillik göstərən qəhvəyi böcəyin (Halyomorpha halys) tam uzunluqlu genləri Nanchung və Inactive seçildi. Sintez edilmiş genlər insan ifadəsi üçün kodonla optimallaşdırıldı və XhoI və EcoRI restriksiya sahələrindən istifadə edərək pBacMam pCMV-DEST vektoruna (Life Technologies) klonlaşdırıldı. Bu, klonların HRC-3C proteaz (PPX) tərəfindən parçalanan C-terminal GFP-FLAG-10xHis və mCherry-FLAG-10xHis etiketləri ilə çərçivədə olmasını təmin etdi və bu etiketlər müstəqil şəkildə mutasiya etməyə imkan verdi.ifadəNanchung və Inactive-i pBacMam vektoruna klonlaşdırmaq üçün istifadə edilən primerlər aşağıdakılar idi:
Fərdi hissəciklərin mikroskopik görüntüləri K3 kamerası və Gatan BioQuantum enerji filtri ilə təchiz olunmuş Titan Krios G2 ötürücü elektron mikroskopunda (FEI) əldə edilmişdir. Mikroskop 300 keV-də, 20 eV enerji qəbulu, 1.08 Å/piksel nümunə piksel ölçüsü (nominal böyütmə 81.000x) və -0.8 ilə -2.2 μm arasında dəyişən defokus qradiyenti ilə işlədildi. Video qeyd, nominal doza sürəti 25 e–px−1 s−1, 2.4 saniyəlik ekspozisiya müddəti və ümumi dozası təxminən 60 e–Å−2 olan Latitude S mikroskopu (Gatan) istifadə edilərək saniyədə 40 kadr sürətlə aparıldı.
Şüa ilə induksiya edilmiş hərəkət korreksiyası və doza ağırlığı RELION 4.061-də MotionCor2 istifadə edərək film üzərində aparılmışdır. Kontrast ötürmə funksiyası (CTF) parametrinin qiymətləndirilməsi yamaq əsaslı CTF qiymətləndirmə metodundan istifadə edərək krioSPARC-da aparılmışdır62. CTF uyğunluq qətnaməsi ≥4 Å olan fotomikroqraflar sonrakı təhlildən kənarlaşdırılmışdır. Tipik olaraq, krioSPARC-da nöqtə seçimi üçün 500-1000 fotomikroqrafdan ibarət bir alt dəst istifadə edilmişdir, ardınca şablon əsaslı hissəcik seçimi üçün aydın bir istinad görüntüsü əldə etmək üçün filtrdən sonra bir neçə mərhələdə 2D təsnifatı aparılmışdır. Daha sonra hissəciklər 64 piksellik sərhəd qutuları və 4 qatlı binning istifadə edərək çıxarılmışdır. İstenmeyen hissəcik kateqoriyalarını çıxarmaq üçün bir neçə mərhələdə 2D təsnifatı aparılmışdır. İlkin 3D model ab initio rekonstruksiyası istifadə edilərək yenidən qurulmuş və krioSPARC-da qeyri-bərabər dəqiqləşdirmə istifadə edilərək təkmilləşdirilmişdir. 3D təsnifat krioSPARC və ya RELION-da ARD heterojenliyinə əsaslanaraq aparılmışdır. Membran domenlərinin əhəmiyyətli dərəcədə heterojenliyi müşahidə edilməmişdir. Hissəciklər C1 və C2 metodları ilə təmizləndi; daha yüksək C2 qətnaməsinə malik hissəciklər C2-yə nisbətən simmetrik hesab edildi və Bayes saflaşdırması üçün RELION-a idxal edildi. Daha sonra hissəciklər son qeyri-bərabər və lokal saflaşdırma üçün krioSPARC-a geri köçürüldü. Son qətnamə və hissəcik sayı Cədvəl 1-də göstərilmişdir.
Nan+AP pentamerlərini emal edərkən, membran domenlərinin (xüsusilə də məsamə bölgəsinin) qətnaməsini yaxşılaşdırmaq üçün siqnalın çıxarılması və TMD maskalanması kimi müxtəlif üsulları araşdırdıq. Lakin, məsamə bölgəsindəki potensial ekstremal pozğunluq və TMD-nin ümumi heterojenliyi səbəbindən bu cəhdlər uğursuz oldu. Son qətnamə, əsasən ARD bölgəsini hədəf alan cryoSPARC-da qeyri-bərabər emal metodu ilə avtomatik olaraq yaradılan maska istifadə edilərək hesablandı. Bu, membran domenlərinin (xüsusilə VSLD bölgəsinin) qətnaməsindən xeyli yüksək qətnamə əldə etdi.
Nanchung və Inactive böcəklərinin apo formalarının ilkin de novo modelləri əvvəlcə Coot63 istifadə edilərək, Nan və Iav böcəklərinin modelləri isə aşağı etibarlı bölgələri müəyyən etmək üçün AlphaFold264 istifadə edilərək yaradılıb. Kalmodulin modelləşdirməsi müvafiq olaraq PDB nümunələri 4JPZ56 və 1CFD65-də Ca2+-bağlayıcı və Ca2+-sız modellərin sərt cisim uyğunluqlarına əsaslanıb. Modellər düzgün stereokimya və yaxşı həndəsə təmin etmək üçün sferik təkmilləşdirmədən istifadə edilərək təkmilləşdirilib. Daha sonra fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin və fosfatidilserin yaxşı müəyyən edilmiş lipid sıxlıqları kimi modelləşdirilib və NAM və AP ligandları sıx birləşmələrdə müvafiq sıxlıqlara yerləşdirilib. PHENIX66-da eLBOW istifadə edərək izoformların SMILES sətirindən məhdudiyyət faylları yaradılıb. Nəhayət, modellər PHENIX-də lokal şəbəkə axtarışı və ikinci dərəcəli struktur məhdudiyyətləri ilə qlobal minimumlaşdırmadan istifadə edərək real məkanda təkmilləşdirilib. Modelin təkmilləşdirilməsi və struktur təhlili üçün MolProbity serverindən istifadə edilmişdir və illüstrasiyalar PyMOL və UCSF Chimera X istifadə edilərək aparılmışdır. 67,68,69 Diafraqma təhlili HOLE serveri70 istifadə edilərək və ardıcıllığın qorunması xəritələşdirilməsi Consurf serveri71 istifadə edilərək aparılmışdır.
Statistik təhlil Igor Pro 6.2, Excel Office 365 və GraphPad Prism 7.0 istifadə edilərək aparılmışdır. Bütün kəmiyyət məlumatları orta ± standart xəta (SEM) kimi təqdim olunur. İki qrupu müqayisə etmək üçün Student t-testindən (iki quyruqlu, qoşalaşmamış) istifadə edilmişdir. Birdən çox qrupu müqayisə etmək üçün birtərəfli dispersiya təhlili (ANOVA) və ardınca Dunnett post-hoc testindən istifadə edilmişdir. *P< 0.05, **P< 0.01 və ***PMəlumatların paylanmasından asılı olaraq < 0.001 statistik cəhətdən əhəmiyyətli hesab edilmişdir. Kd, Ki dəyərləri və onların asimmetrik 95% etibarlılıq intervalları GraphPad Prism 10 istifadə edilərək hesablanmışdır.
Tədqiqat metodologiyası haqqında daha ətraflı məlumat üçün bu məqalədə link verilmiş Təbiət Portfeli Hesabatının Xülasəsinə baxın.
İlkin model PDB 4JPZ və 1CFD verilənlər bazalarından kalmodulin modelləri istifadə edilərək qurulmuşdur. Koordinatlar Zülal Məlumat Bankına (PDB) 9NVN (liqandsız Nan-Iav-CaM), 9NVO (nikotinamidə bağlı Nan-Iav-CaM), 9NVP (nikotinamidə və EDTA-ya bağlı Nan-Iav-CaM), 9NVQ (afenidolpirrollinə və kalsiuma bağlı Nan-Iav-CaM), 9NVR (afenidolpirrollinə və EDTA-ya bağlı Nan-Iav-CaM) və 9NVS (afenidolpirrollinə bağlı Nan pentamer) giriş nömrələri altında yerləşdirilib. Müvafiq krio-elektron mikroskopiya təsvirləri Elektron Mikroskopiya Verilənlər Bazasına (EMDB) aşağıdakı giriş nömrələri altında yerləşdirilir: EMD-49844 (liqandsız Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (nikotinamidli Nan-Iav-CaM kompleksi), EMD-49846 (nikotinamid və EDTA ilə Nan-Iav-CaM kompleksi), EMD-49847 (afidopirrollin və kalsium ilə Nan-Iav-CaM kompleksi), EMD-49848 (afidopirrollin və EDTA ilə Nan-Iav-CaM kompleksi) və EMD-49849 (afidopirrollinli Nan pentamer kompleksi). Funksional analiz üçün xammal məlumatlar bu məqalədə təqdim olunur.
Yazı vaxtı: 28 Yanvar 2026